青钱柳多糖调节胰岛和肝脏葡萄糖转运蛋白4转位干预2型糖尿病大鼠的作用机制.pdf

药物研究青钱柳多糖调节胰岛和肝脏葡萄糖转运蛋白 转位干预 型糖尿病大鼠的作用机制刘海云石淼婷骆欣怡孙敏燕徐晨曦陈鲲翰王晓敏舒任庚(江西中医药大学中医学院南昌)摘 要 目的 观察青钱柳多糖调节胰岛和肝脏葡萄糖转运蛋白()转位改善 型糖尿病()大鼠外周胰岛抵抗的作用 方法 建立 大鼠模型(给予高脂饲料后注射链脲佐菌素 )将造模成功的大鼠随机分为模型对照组青钱柳多糖提取物小、大剂量组()和盐酸二甲双胍组(.)每组 只给药 周 测定空腹血糖、血脂变化苏木精伊红染色法观察胰岛和肝脏病理形态的改变免疫组化法观察胰岛磷酸化磷酯酰肌醇 激酶()、磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶()、蛋白的表达免疫荧光观察肝脏和胰岛 转位 结果 与模型对照组比较青钱柳多糖提取物小、大剂量组和盐酸二甲双胍组大鼠胰岛和肝脏结构较完整血糖下降(.)高密度脂蛋白升高(.)胰岛、蛋白表达升高(.)肝脏和胰岛 转位增强(.)结论 青钱柳多糖可调节 大鼠糖脂紊乱其机制可能是增强胰岛、蛋白的表达促进肝脏和胰岛 转位从而调节外周胰岛抵抗关键词 青钱柳多糖葡萄糖转运蛋白 转位外周胰岛素抵抗 型糖尿病中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(.)()(.)().()()(.)().()().(.).(.).(.大鼠则为造模成功 大鼠随机分为 组即正常对照组、模型对照组、小剂量组、大剂量组、二甲双胍组每组 只 正常对照组和 模 型 对 照 组 均 灌 胃 给 予.氯 化 钠 溶 液 小剂量组给予 大剂量组给予 二甲双胍组给予盐酸二甲 双 胍.均 灌 胃 给 予 体 积 均 为 灌胃 周.大鼠的一般情况及体质量变化观察各组大鼠的行为学改变、活动度、皮肤毛发、饮食、饮水情况等一般状况分别于实验前和每周末称取大鼠体质量各 次连续 周.血糖和血脂测定 待大鼠禁食 后予 水合氯醛麻醉眼球取血静置 转速离心 吸取血清测定空腹血糖值和、含量严格参照说明书操作.染色法观察肝脏和胰岛病理形态的改变切取胰腺的胰尾部分和肝左叶用甲醛固定后石蜡包埋切片进行常规 染色观察胰岛和肝脏组织学变化严格参照说明书操作.免疫组化法检测胰岛、和 表达 将胰腺石蜡切片厚度约 烘烤 待蜡融化后趁热放入二甲苯、梯度乙醇进行透明和脱水用磷酸盐缓冲液()清洗后加入 过氧化氢()在室温下孵育放入高压锅进行热修复抗原 滴加、抗体分别按照、比例稀释正常对照组滴加 过夜 显色在光镜下观察组织变为浅棕色即停止反应 全自动数字切片扫描与应用系统采集图片并选取 倍视野/张切片 个用 .版软件进行图像分析.免疫荧光观察 转位胰腺和肝脏组织石蜡切片脱蜡至水后切片浸没 值.柠檬酸缓冲液中放入微波炉内进行抗原热修复自然冷却用 缓冲液晃动洗涤切片稍甩干加入自发荧光淬灭剂 流 水 冲 洗 滴 加 牛 血 清 清 蛋 白()封闭孵育 滴加 比例稀释的 一抗后放入湿盒 孵育过夜 连续 次 洗涤后滴加二抗后避光室温孵育 晃动洗涤滴加 二脒基苯基吲哚()染液避光室温孵育 连续 次每次 晃动洗涤 抗荧光淬灭封片剂封片并荧光显微镜下观察转位情况并采集图像 采用 软件分析图像得出灰度值后计算相对荧光强度值给药组平均强度/正常对照组平均强度.统计学方法 实验计量数据采用均数标准差()表示 应用 .版软件进行统计学分析组间比较采用单因素方差分析两两比较方差齐时用 检验方差不齐时用 检验以.为差异有统计学意义 结果.各组大鼠的基本状态及体质量情况正常对照组大鼠实验期精神状况良好活动敏锐毛色光亮 模型对照组大鼠懒惰厌动毛色发黄并易脱毛消瘦多食多饮和多尿 组和二甲双胍组大鼠的“三多一少”症状有所改善 造模前各组间大鼠体质量均差异无统计学意义 造模成功后与正常对照组比较其余各组大鼠体质量明显升高(.)给药 周后 大剂量组和二甲双胍组大鼠的体质量均有所增加与模型对照组比较差异有统计学意义(.)结果见表 表 组大鼠不同时间的体质量变化.组别造模前给药前给药 周正常对照组.模型对照组.二甲双胍组.小剂量组.大剂量组.与模型对照组比较 .与模型对照组比较.各组大鼠空腹血糖测定结果造模前各组间大鼠空腹血糖无明显差异 造模后大鼠血糖明显升高与正常对照组比较差异有统计学意义(.)给药 周后与模型对照组比较 大剂量组和二甲双胍组大鼠空腹血糖明显下降(.)结果见表 表 组大鼠不同时间的空腹血糖.组别造模前给药前给药 周正常对照组.模型对照组.二甲双胍组.小剂量组.大剂量组.与模型对照组比较.、.与模型对照组比较.、.各组大鼠血脂的测定结果 与正常对照组比较模型对照组 升高 下降(.)提示模型对照组大鼠的血脂紊乱 与模型对照组比较大、小剂量组和二甲双胍组 升高(.)且二甲双胍的效果优于 提示 主要是提高 水平 见表 表 组大鼠血脂的测定结果.组别正常对照组.模型对照组.二甲双胍组.小剂量组.大剂量组.与正常对照组比较.、.与模型对照组比较.各组大鼠胰岛和肝脏形态改变正常对照组胰岛细胞数量多排列有序呈椭圆形或圆形边界清晰模型对照组大鼠的胰岛受损形状不规则边界模糊细胞排列紊乱纤维组织增多有炎症细胞浸润 大、小剂量组与二甲双胍组的胰岛相对完整形状接近椭圆形边界相对清晰细胞排列有序仅有少数胰岛细胞变性或坏死及少量炎症细胞浸润正常对照组大鼠肝小叶完整肝细胞大小正常细胞呈圆形细胞核居中以中央静脉为中心呈放射状模型对照组大鼠有较多肝细胞发生脂肪变性部分肝细胞出现核固缩 给药组肝细胞脂肪变性明显好转肝小叶结构较完整 见图.各组大鼠胰岛细胞、蛋白表达 和 免疫组织化学阳性表达均位于细胞质 阳性表达主要位于细胞质和细胞核 与正常对照组比较模型对照组胰岛的、蛋白平均灰度值明显降低(.或.)与模型对照组比较 大剂量组和二甲双胍组胰岛 和、阳性表达明显升高(.或.)提示 能提高胰岛、蛋白表达 见图.各组大鼠胰岛细胞和肝细胞 移位 荧光染色在胰岛细胞和肝细胞的细胞质和细胞膜均表达显示红色荧光 是细胞膜上一种转运蛋白如细胞质也有表达提示细胞质的 囊泡可能向细胞膜发生转位 在模型对照组 中 胰 岛 细 胞 和 肝 细 胞 的 细 胞 质 和 细 胞 膜 染色较少 与模型对照组比较 给药组的细胞质和细胞膜的 荧光强度增加 这表明 可促进胰岛细胞和肝细胞 囊泡向细胞膜上转位 见图 讨论中医“消渴”症涵盖糖尿病病由热生热极成毒因而热毒是“消渴病”重要病因 清热解毒中药对糖.正常对照组.模型对照组.小剂量组.大剂量组.二甲双胍组图 组大鼠胰岛和肝脏组织形态学(染色).().正常对照组.模型对照组.小剂量组.大剂量组.二甲双胍组 与模型对照组比较.与模型对照组比较.、.图 组大鼠胰岛、蛋白表达(免疫组化).().正常对照组.模型对照组.小剂量组.大剂量组.二甲双胍组 与模型对照组比较.与模型对照组比较.图 组大鼠胰岛和肝脏 蛋白的表达和定位(免疫荧光).()尿病具有疗效好、不良反应少等优势 青钱柳是我国特有的单种属植物其枝叶味甘甜具有清热消肿、镇痛的功效是一种能降血糖的茶叶 近年来多项研究均发现 具有良好的降低血糖、改善血脂作用 机体葡萄糖和脂质代谢的紊乱是引起胰岛抵抗关键环节 彭晓娟等的研究表明 显著减轻非酒精性脂肪性肝病/大鼠代谢紊乱、肝脏脂肪变性及炎症反应能够抑制肝脏及脂肪组织过氧化物医药导报 年 月第 卷第 期酶体增殖物激活受体 和增强子结合蛋白 的表达量提示 可通过肝胰岛素抵抗降低血糖 本课题组前期研究表明 具有降低血糖、胰岛素水平和胰岛素抗体的作用 本研究进一步观察其对肝脏和胰岛形态影响及 转位影响结果表明给予 周后模型大鼠一般症状有所好转血糖下降和 上升且 大剂量组的胰岛近似椭圆形结构较完整边界较清晰炎症细胞和纤维组织明显减少损伤的胰岛有所修复且脂质变性的肝细胞数量也明显减少进一步提示 大剂量组具有良好的降血糖与降血脂药理作用能改善高脂和链脲佐菌素造成的肝脏和胰岛损伤 本结果与相关文献报道相似肝脏、骨骼肌和脂肪组织等外周胰岛素抵抗是胰岛素抵抗重要组成部分胰岛素通过与肝脏、骨骼肌等器官细胞膜胰岛受体结合激活下游/促进肝和肌肉等细胞中葡萄糖转运蛋白从细胞质转移到细胞膜上促进葡萄糖摄取 胰岛素/信号转导通路蛋白的缺失和异常可导致 的表达减少、易位受阻及含 囊泡不能与细胞膜融合、活性降低等导致胰岛素抵抗的发生 是一种膜蛋白主要在肝脏、骨骼肌和脂肪细胞表达主要储藏在细胞内囊泡是外周组织转运葡萄糖的重要载体蛋白 胰岛素与肝脏、骨骼肌、脂肪等各种靶细胞膜胰岛素受体相结合后 磷酸化激活下游/通路促发 囊泡以胞吐形式向细胞表面转位靶组织对葡萄糖摄取增加 研究表明 既可通过肝脏、骨骼肌和胰岛等组织细胞上调跨膜转运蛋白 表达及转位同时也能够激活下游线粒体的功能调节生物体内的代谢和能量平衡 因而 是 转位必需的信号分子之一 本实验结果提示 组能够升高 大鼠胰岛细胞、蛋白表达 免疫荧光结果可直观观察到模型对照组的胰岛细胞和肝细胞 免疫荧光强度明显减弱而 组胰岛细胞和肝细胞的细胞质和细胞膜 荧光强度升高 该结果提示 可能促进肝脏和胰岛细胞质内 向细胞膜转位且胰岛、蛋白表达增多提高肝细胞和胰岛摄取葡萄糖从而降低血糖水平综上所述本研究表明 具有降低 模型大鼠血糖和升高 水平的药理作用减轻高糖对胰岛和肝脏的损伤其机制可能是通过上调胰岛、含量并促进胰岛细胞和肝细胞 转位 但是其以胰岛和肝脏哪个为主导还是两者的协同作用有待进一步深入研究参考文献 邓明群潘琦肖新华等.中国老年糖尿病诊疗指南(年版)解读.中华内科杂志():.():.:.:.():.().():.王晓敏邹志坚陈月梅等.青钱柳多糖对糖尿病小鼠血清胰岛素和胰岛素抗体的作用.时珍国医国药():.邹志坚王晓敏冯劲松等.青钱柳水提液对糖尿病小鼠降血糖作用.江西中医学院学报():.李俊梁晓琴常燕玲等.青钱柳的化学成分及药理活性研究进展.广西师范大学学报(自然科学版)():.姚瑶.青钱柳及其组方抗 型糖尿病研究与机制探讨.南昌:江西中医药大学:.舒任庚蔡永红.微波辅助水解青钱柳多糖的工艺研究.中草药():.夏敬胜王倩邹吉利等.黄连素促进 型糖尿病大鼠胰高血糖素样肽分泌的分子机制.医药导报():.朱艳娟程静丽高忠爱等.姜黄素促进骨骼肌 转位改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗.中华内分泌代谢杂志():.孙瑞茜.型糖尿病清热益气治法的传承及机制研究.北京:北京中医药大学:.:.():.():.彭晓娟钟绿吴楚添等.青钱柳多糖和青钱柳黄酮对非酒精性脂肪性肝病合并 型糖尿病模型大鼠血液代 谢指标及肝脏病变的影响.中国病理生理杂志():.龙伟清彭永健何晓敏等.青钱柳叶提取物对 型糖尿病模型大鼠的治疗作用.中药材():.():.!.:.:/.:.淫羊藿苷调控/通路对高糖诱导的足细胞自噬及凋亡的影响李明霞杨谦乔海霞王晓玲贾丽媛胡利梅任卫东(.河北北方学院附属第一医院内分泌科张家口.河北北方学院张家口)摘 要 目的 探讨淫羊藿苷对高糖诱导的足细胞自噬、凋亡及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶()/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白()通路的影响 方法 将小鼠足细胞 分为 组:正常对照组(.葡萄糖)、高糖组(葡萄糖)、淫羊藿苷组(葡萄糖 淫羊藿苷)、组(葡萄糖 )、淫羊藿苷 组(葡萄糖 淫羊藿苷)培养 后噻唑蓝法检测 细胞活力吖啶橙染色观察 细胞自噬情况流式细胞术检测 细胞凋亡蛋白印迹法检测 细胞自噬微管相关蛋白 轻链()、自噬相关蛋白()、凋亡 相关 蛋白()、淋巴细胞瘤()和/通路相关蛋白的表达 结果 与正常对照组比较高糖组 细胞活力、磷酸化()/、磷酸化()/、磷酸化()/蛋白表达水平显著降低(.)自噬能力增强自噬体表现出橙色荧光细胞凋亡率、/、蛋白表达水平显著升高(.)与高糖组比较淫羊藿苷组 细胞活力、/、/、/、/蛋白表达水平显著升高自噬能力进一步增强自噬体数量增多自噬体呈现出砖红色荧光(.)细胞凋亡率、蛋白表达水平显著降低(.)组 细胞活力、/、/、/、/蛋白表达水平显著降低自噬能力减弱自噬体数量减少自噬体表现出橙色荧光(.)细胞凋亡率、蛋白表达水平显著升高(.)淫羊藿苷 可逆转淫羊藿苷对高糖诱导 细胞的作用效果(.)结论淫羊藿苷通过激活/通路促进高糖诱导的足细胞自噬抑制细胞凋亡关键词 淫羊藿苷哺乳动物雷帕霉素靶蛋白蛋白激酶 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白高糖足细胞自噬凋亡中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()/(.)()/()/().:(.)()()()().医药导报 年 月第 卷第 期