雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎%28EAU%29小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响.pdf

欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：庞彬彬，夏沁韵，陈震，邢怡桥 雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎（）小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响 眼科新进展，（）：，：【实验研究】雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎（）小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响庞彬彬夏沁韵陈震邢怡桥欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者 简 介：庞 彬 彬（：），女，年 月出生，湖北十堰人，在读硕士研究生。研究方向：葡萄膜视网膜疾病。：通信 作 者：邢 怡 桥（：），男，年 月出生，湖北武汉人，博士，主任医师，教授，博士研究生导师。研究方向：葡萄膜视网膜疾病。：收稿日期：修回日期：本文编辑：董建军基金项目：湖北省卫生健康委员会面上项目（编号：）作者单位：湖北省武汉市，武汉大学人民医院眼科中心【摘要】目的探讨雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎（）小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响。方法取健康 周龄 小鼠 只，随机分为正常对照组、溶剂对照组、雷公藤红素干预组，每组 只。将光感受器间维生素 类结合蛋白 和完全弗氏佐剂充分乳化混合后，注射于 溶剂对照组和雷公藤红素干预组小鼠双侧大腿和尾部皮下，总体积 ，每只小鼠注射光感受器间维生素 类结合蛋白 的量为 。免疫后第 天，雷公藤红素干预组小鼠每天接受 雷公藤红素腹腔注射治疗，溶剂对照组小鼠注射同等剂量的无菌 缓冲溶液。免疫后第 天，通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节表现及行组织切片 染色，并参照 分级标准对各组小鼠进行临床评分及组织病理学评分；免疫荧光染色观察小鼠眼内小胶质细胞活化情况；检测小鼠视网膜中诱导型一氧化氮合酶（）、精氨酸酶 （）蛋白表达水平；检测小鼠视网膜中炎症因子肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、相对表达量。采用 统计软件进行数据分析。结果免疫后第 天，通过裂隙灯显微镜观察发现，溶剂对照组小鼠眼前节可见虹膜血管扩张充血明显、角膜水肿、前房渗出；而雷公藤红素干预组小鼠眼前节炎症明显减轻，可见虹膜血管轻度充血。与正常对照组相比，溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠临床评分均升高，差异均有统计学意义（均为 ）。雷公藤红素干预组小鼠临床评分低于 溶剂对照组，差异有统计学意义（）。染色结果显示，免疫后第 天，溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离，炎症细胞弥漫浸润；而雷公藤红素干预组小鼠视网膜结构破坏轻微，可见少量炎症细胞浸润。与正常对照组相比，溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分均升高，差异均有统计学意义（均为 ）。雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分低于 溶剂对照组，差异有统计学意义（）。正常对照组、溶剂对照组、雷公藤红素干预组小鼠眼内 细胞密度分别为（）、（）、（），与正常对照组相比，溶剂对照组及雷公藤红素干预组小鼠眼内 细胞数增加，差异均有统计学意义（均为 ）；与 溶剂对照组相比，雷公藤红素干预组小鼠眼内 细胞数明显减少，差异有统计学意义（）。与正常对照组相比，溶剂对照组小鼠视网膜中 、蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义（均为 ）；与 溶剂对照组相比，雷公藤红素干预组小鼠视网膜中 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（）。与正常对照组相比，溶剂对照组小鼠视网膜中 、相对表达量均升高，差异均有统计学意义（均为 ）；与 溶剂对照组相比，雷公藤红素干预组小鼠视网膜中 、相对表达量均下降，差异均有统计学意义（均为 ）。结论雷公藤红素可抑制 型小胶质细胞活化，减少 小鼠视网膜炎症因子 、的产生，减轻炎症反应。【关键词】雷公藤红素；实验性自身免疫性葡萄膜炎；小胶质细胞；诱导型一氧化氮合酶；精氨酸酶【中图分类号】自身免疫性葡萄膜炎是累及葡萄膜、视网膜等多个部位的眼内非感染性炎症，病因复杂，常可导致严重的视功能损害 。目前，皮质类固醇和免疫抑制剂是治疗葡萄膜炎的主要药物，但长期使用可引起局部或全身毒副作用 。因此，寻找安全有效的治疗药物是葡萄膜炎研究的重要课题。小胶质细胞是常驻于视网膜和中枢神经系统中的免疫细胞，参与多种神经退行性疾病和眼部疾病的发生、发展和预后 。研究表明，抑制 型小胶质细胞活化或调节 型小胶质细胞极化平衡可以缓解自身免疫性葡萄膜炎的发展 。雷公藤红素是来源于中草药雷公藤的主要活性天然产物之一，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗肥胖等多种生物学功能 。研究发现，雷公藤红素可抑制阿尔茨海默病患者小胶质细胞活化，减少炎症因子产生和神经元死亡，延缓患者认知衰退；人们推测雷公藤红素能通过调节小胶质细胞极化，进而减轻葡萄膜炎的进一步发展 。本研究利用小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（）模型，探讨雷公藤红素在 小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响，为葡萄膜炎的治疗提供新的思路和理论依据。：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 材料与方法 材料 实验动物取健康 周龄 小鼠 只，购自 实验室，饲养于武汉大学人民医院动物实验中心 环境中，明暗循环 。动物饲养及实验操作严格遵守 湖北省实验动物管理条例，并获得武汉大学人民医院动物伦理委员会许可 批准号：动（福）第 号。主要试剂及仪器光感受器间维生素 类结合蛋白 （上海生工生物工程股份有限公司），完全弗氏佐剂（美国 公司），雷公藤红素（上海皓元生物医药科技有限公司），抗 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司），抗诱导型一氧化氮合酶（）、精氨酸酶 （）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），抗离子钙结合适配器分子 （）抗体（美国 公司），（美国 公司），提取及逆转录试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；荧光定量 仪（美国 公司），酶标仪（美国 公司），正置荧光显微镜 （日本 株式会社）。方法 实验动物分组及处理采用随机数字表法将 只小鼠分为正常对照组、溶剂对照组、雷公藤红素干预组，每组 只。参照文献 ，将光感受器间维生素 类结合蛋白 和完全弗氏佐剂充分乳化混合后，注射于 溶剂对照组和雷公藤红素干预组小鼠双侧大腿和尾部皮下，总体积 ，每只小鼠注射光感受器间维生素 类结合蛋白 的量为 。免疫后第 天，在裂隙灯下观察小鼠眼前节反应，确保造模成功。第 天，雷公藤红素干预组小鼠每天接受 雷公藤红素腹腔注射治疗，溶剂对照组小鼠注射同等剂量的无菌 缓冲溶液。小鼠临床评分及组织病理学评分免疫后第 天，每组各取 只小鼠，通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节表现，并参照 分级标准进行 临床评分 。处死小鼠，取双侧眼球，用眼球固定液固定 ，石蜡包埋，沿瞳孔 视神经轴收集连续的 切片，并用 染色，在显微镜下根据 分级标准进行组织病理学评分。免疫荧光染色检测小胶质细胞活化情况将各组小鼠石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复后，用体积分数 封闭 ；加抗 抗体（）孵育过夜，洗涤；二抗 （）室温孵育 ，洗涤；最后，用 室温孵育 。予以抗荧光淬灭剂封片后在荧光显微镜下观察、记录各组小鼠小胶质细胞活化情况。检测 、蛋白表达免疫后第 天，每组各取 只小鼠处死，摘除双侧眼球。分离小鼠视网膜组织，加入 组织细胞裂解液，使用超声粉碎仪冰上粉碎裂解视网膜，离心并收集上清，法检测并计算各组样品的蛋白浓度。采用 进行电泳，转膜、封闭处理后，加抗 抗体（）、抗 抗体（）、抗 抗体（），孵育过夜。第 天，洗涤，二抗室温敷育 ，经 洗涤后，予以 显色成像。应用 软件分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量 目的蛋白条带灰度值 条带灰度值。检测炎症因子肿瘤坏死因子 、白细胞介素 、白细胞介素 表达免疫后第 天，每组各取处死 只小鼠，摘除双侧眼球。在无酶条件下分离小鼠视网膜组织，采用 提取视网膜总 ，将 逆转录成 ，随后以 为模板按照如下体系进行 检测。引物序列如下：上游引物为 ，下游引物为 ；肿瘤坏死因子（）上游引物为 ，下游引物为 ；白细胞介素（）上游引物为 ，下游引物为 ；上游引物为 ，下游引物为 。反应体系为每孔 ，反应条件为：、，循环 次；、，、，循环 次；、，、，、，循环 次。完成后，按 计算 相对表达量。统计学分析采用 统计软件进行数据分析，计量资料以均数 标准差表示，组间比较采用单因素方差分析（），两两比较采用 检验。检验水准：。结果 各组小鼠眼前节表现及临床评分免疫后第 天，通过裂隙灯显微镜观察发现，溶剂对照组小鼠眼前节可见虹膜血管扩张充血明显、角膜水肿、前房渗出；而雷公藤红素干预组小鼠眼前节炎症明显减轻，可见虹膜血管轻度充血（图）。各组小鼠临床评分，总体差异有统计学意义（，）；与正常对照组相比，溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠临床评分均升高，差异均有统计学意义（均为 ）。雷公藤眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：红素干预组小鼠临床评分低于 溶剂对照组，差异有统计学意义（）（表 ）。：正常对照组；：溶剂对照组；：雷公藤红素干预组。蓝色箭头示角膜水肿及渗出，黄色箭头示角巩膜区血管。图 免疫后第 天各组小鼠裂隙灯显微镜下眼前节表现表 免疫后第 天各组小鼠临床评分及组织病理学评分组别临床评分 分组织病理学评分 分正常对照组 溶剂对照组 雷公藤红素干预组 注：与正常对照组相比，；与 溶剂对照组相比，。各组小鼠 染色结果及组织病理学评分 染色结果显示，免疫后第 天，溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离，炎症细胞弥漫浸润；而雷公藤红素干预组小鼠视网膜结构破坏轻微，可见少量炎症细胞浸润（图 ）。各组小鼠组织病理学评分总体差异有统计学意义（，）。与正常对照组相比，溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分均升高，差异均有统计学意义（均为 ）。雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分低于 溶剂对照组，差异有统计学意义（）（表 ）。：正常对照组；：溶剂对照组；：雷公藤红素干预组。图 各组小鼠视网膜组织 染色结果（）各组小鼠眼内小胶质细胞活化情况利用 进行免疫荧光染色结果发现，免疫后第 天，溶剂对照组小鼠小胶质细胞活化增多，细胞增大变形，散在分布；而雷公藤红素干预组小鼠小胶质细胞活化明显减少，主要分布于神经节细胞层、内丛状层和外丛状层。正常对照组、溶剂对照组、雷公藤红素干预组小鼠眼内 细胞密度分别为（）、（）、（），各组 细胞数总体比较差异有统计学意义（，）。与正常对照组相比，溶剂对照组及雷公藤红素干预组小鼠眼内 细胞数增加，差异均有统计学意义（均为 ）；与 溶剂对照组相比，雷公藤红素干预组小鼠眼内 细胞数明显减少，差异有统计学意义（）（图 ）。免疫反应细胞核阳性染色为蓝色，免疫反应小胶质细胞阳性染色为绿色。：神经节细胞层；：内丛状层；：内核层；：外丛状层；：外核层。图 各组小鼠眼内小胶质细胞活化情况 各组小鼠视网膜 、蛋白表达水平 检测结果显示，免疫后第 天，各组小鼠视网膜 、蛋白表达水平总体比较差异均有统计学意义（、，均为 ）；与正常对照组相比，溶剂对照组小鼠视网膜中 、蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义（均为 ）；与 溶剂对照组相比，雷公藤红素干预组小鼠视网膜中 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（），而 表达水平差异无统计学意义（）（图 ）。各组小鼠视网膜炎症因子 、表达水平 检测结果显示，免疫后第 天，各组小鼠视网膜中 、相对表达量总体比较差异均有统计学意义（、，均为 ）。与正常对照组相比，溶剂对照组小鼠视网膜中 、相对表达量均升高，差异均有统计学意义（均为 ）；与 溶剂对照组相比，雷公藤红素干预组 ：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 小鼠视网膜中 、相对表达量均下降，差异均有统计学意义（均为 ）（表）。，示差异无统计学意义。图 各组小鼠视网膜 、蛋白表达水平表 各组小鼠视网膜炎症因子 、表达水平组别 相对表达量 正常对照组 溶剂对照组 雷公藤红素干预组 注：与正常对照组相比，；与 溶剂对照组相比，。讨论雷公藤红素于 年被发现，它是最有可能开发成现代药物的分子之一 。其在多种自身免疫性疾病中发挥保护作用。本研究中，我们每天给予 小鼠腹腔注射 雷公藤红素进行治疗。结果显示，溶剂对照组小鼠出现虹膜血管扩张充血、角膜水肿、前房渗出等明显炎症反应；染色显示 溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离，炎症细胞弥漫浸润。而雷公藤红素干预组小鼠炎症反应及视网膜结构破坏均明显减轻。这表明雷公藤红素可减轻 小鼠视网膜的炎症反应，具有很好的抗炎作用。在生理条件下，小胶质细胞呈高度分支状，主要局限于视网膜神经节细胞层、内丛状层和外丛状层；当暴露于病理性刺激环境时，小胶质细胞迅速增大变形为阿米巴状，迁移到损伤部位，并引起许多免疫反应 。是检测小胶质细胞活化的经典标志物 。我们利用 标记小胶质细胞，结果显示，正常小鼠中，小胶质细胞活化几乎不可见，而 免疫后小鼠眼内小胶质细胞活化明显增加，细胞增大变形，并迁移到视网膜各层及玻璃体内；而雷公藤红素干预后小胶质细胞活化数量显著减少且分布主要局限于视网膜神经节细胞层、内丛状层和外丛状层。这表明雷公藤红素可抑制 小鼠中小胶质细胞活化。小胶质细胞极化分为“经典激活”的 型及“替代激活”的 型，活化为 型时会促进炎症反应，导致组织损伤，而活化为 型时则参与炎症消退、免疫调节和组织修复等 。型小胶质细胞活化主要产生 、等促炎细胞因子，而 型小胶质细胞则主要表达 、等抗炎细胞因子 。、是代表 、型小胶质细胞的经典标志物 。为了进一步探究雷公藤红素对小胶质细胞极化的影响，我们用 分别检测小鼠视网膜 、蛋白表达水平。结果显示，免疫后第 天，、蛋白表达水平均升高；雷公藤红素干预后，表达水平降低，而 蛋白表达无明显改变。同时，检测结果显示，雷公藤红素干预后，、相对表达量均明显降低。这表明雷公藤红素可抑制 型小胶质细胞活化及其相关炎症因子表达。本研究尚存在一些不足，如我们只探究了雷公藤红素对 小鼠体内小胶质细胞活化的影响，而其在体外对小胶质细胞活化的影响未曾探究。另外，还需探讨梯度浓度雷公藤红素干预对于 的治疗作用，发掘安全有效的最低药物浓度。虽然雷公藤红素在 治疗中表现出显著效果，但由于其水溶性较差等原因，生物利用度有限，这会限制其在临床中的应用。结论本实验结果表明，雷公藤红素可抑制 型小胶质细胞活化，减少 小鼠视网膜炎症因子 、的产生，减轻炎症反应。其有望成为治疗自身免疫性葡萄膜炎的有效手段。参考文献?，：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，?，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：【】（），（），（）；（）（）；，（），（），；，（）；（），（下转第 页）：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ，：，：【】（），（）（）（）（），（）（），（），：（，），（，），（，）（），（）（），（）（）（，），（），（），（），（，），（）（，）；（，），（，），（，），；【】；欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁 （上接第 页），（）；（），（），（），（），（）；，（），（）；，（），（）；，（），【】；：眼 科新进展 年 月第 卷第 期