酱醪贝莱斯芽胞杆菌四甲基吡嗪高产菌的选育及其发酵优化.pdf

酱醪贝莱斯芽胞杆菌四甲基吡嗪高产菌的选育及其发酵优化万雨薇1袁林琛1袁闫子恒1袁王洁丽1袁刘俊良1袁韦现鹏1袁周尚庭2袁3袁蒋雪薇1袁2*渊1长沙理工大学食品与生物工程学院长沙 4101142湖南省调味品发酵工程技术研究中心长沙 4106003加加食品集团股份有限公司长沙 410600冤摘要为获得四甲基吡嗪渊TTMP冤高产发酵菌株袁以酱醪中筛选的贝莱斯芽胞杆菌 CS1.11 为出发菌株袁进行紫外诱变袁以酪素平板水解圈直径及乙偶姻显色反应为指标进行初筛袁以蒸煮豆粕和焙炒小麦为原料固态发酵 TTMP 进行复筛袁得到 3株突变株遥 蛋白酶尧淀粉酶活力及乙偶姻合成能力研究表明袁其中 2 株突变株 CS1.11-32尧CS1.11-33 更优袁其 TTMP 的积累量较出发菌株分别提升了 47.64%袁78.89%袁适用于酱油发酵体系遥 对影响 TTMP 积累的炒麦添加量尧加水量尧接种量尧发酵温度及搅拌次数进行 2 株菌的对比发酵研究袁CS1.11-33 显示出更优的 TTMP 积累能力遥 响应面试验优化得出 CS1.11-33固态发酵积累 TTMP 的最佳发酵条件为院炒麦添加量 44%袁加水量 29%袁发酵温度 37 益袁接种量 8%袁发酵过程中不进行搅拌袁在此条件下 TTMP 积累量最大达到 1 895.08 mg/kg 干基袁是其优化前的 2.6 倍遥 酱醪贝莱斯芽胞杆菌 TTMP 高产株的选育及其发酵研究将为提高酱油中 TTMP 浓度尧快速增强酱香及促进 TTMP 的功能性应用奠定基础遥关键词四甲基吡嗪曰 贝莱斯芽胞杆菌曰 选育曰 酱醪曰 响应面优化文章编号1009-7848渊2023冤08-0175-11DOI院 10.16429/j.1009-7848.2023.08.019吡嗪是一类含 2 个对称氮原子的六元杂环化合物袁天然存在于可可豆或大豆发酵食品中袁因具有易挥发尧香味阈值低尧对其它香味有显著的烘托和叠加作用的特点袁 常被作为香料添加剂广泛应用于食品中1遥 四甲基吡嗪渊2袁3袁5袁6-Tetram鄄ethylpyrazine袁 TTMP冤袁又名川芎嗪袁是中药川芎中的活性生物碱袁具有扩张小动脉袁活血化瘀及改善微循环的作用袁 也是治疗心脑血管疾病的有效成分2-3遥 TTMP 常存在于各种发酵食品中袁如酱香型白酒4尧醋5和纳豆6等袁发酵大豆中 TTMP 的香气阈值为 10 mg/kg袁其焙烤尧坚果香气有助于酱香风味的形成袁 此外袁TTMP 还能赋予发酵食品一定的健康保健功能7遥发酵食品中 TTMP 的产生与微生物作用密切相关遥 吴建峰等8研究了枯草芽孢杆菌渊Bacillussubtilis冤在固态发酵条件下 TTMP 的合成机制袁结果表明院该菌能利用底物合成乙偶姻袁同时微生物分泌的氨基酸脱氢酶作用于氨基酸残基生成氨袁乙偶姻和氨通过自发反应生成 TTMP遥外源添加乙偶姻对 TTMP 产量的提高有显著促进作用袁然而袁前体物乙偶姻浓度过高会对细胞产生毒害作用袁导致乙偶姻利用率不高袁 因此筛选内源性乙偶姻积累菌株更有利于生物发酵合成 TTMP9-10遥 钟桂芳等11通过初步筛选产乙偶姻的菌株袁进而复筛TTMP 的产生菌株袁得到 2 株可应用于提升原酒中TTMP 产量的芽胞杆菌遥 Zhang 等12从高温大曲中筛选 1 株高产 TTMP 的解淀粉芽胞杆菌渊Bacillusamyloliquefaciens冤袁经单因素和响应面优化袁得到功能麸曲制备工艺袁TTMP 最高产量达到 1.28伊103mg/kg遥酱油中最常见的吡嗪类化合物包括 2-甲基吡嗪尧2袁6-二甲基吡嗪渊2袁6-Dimethylpyrazine袁 2袁6-DMP冤尧2袁5-二甲基吡嗪渊2袁5-Dimethylpyrazine袁2袁5-DMP冤尧2-乙基-6-甲基吡嗪尧2袁3袁5-三甲基吡嗪渊2袁3袁5-Trimethylpyrazine袁 2袁3袁5-TMP冤13遥 吡嗪类物质虽在酱油中含量不高袁但香气阈值低袁其对酱油香气形成至关重要14-15遥芽胞杆菌是酱醪发酵阶段比较重要的细菌遥 吴博华等16从高盐稀态酱醪中分离 3 株具有吡嗪类物质积累能力的芽胞收稿日期院 2022-08-09基金项目院 湖南省自然科学基金面上项目渊2021JJ30700冤曰湖南省教育厅重点项目渊21A0197冤曰长沙市科技计划重点研发项目渊kq2004072袁kh2005095冤第一作者院 万雨薇袁女袁硕士生通信作者院 蒋雪薇E-mail院 jxw_灾燥造援 23 晕燥援 8Aug援 圆 园 2 3允燥怎则灶葬造 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠中 国 食 品 学 报第 23 卷第 8 期圆 园 2 3 年 8 月中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期杆菌袁其中贝莱斯芽胞杆菌渊B.velezensis冤为最具TTMP 积累潜力的菌株遥贝莱斯芽胞杆菌因最早分离自西班牙南部贝莱斯河而得名袁 曾被命名为解淀粉芽胞杆菌的植物亚种袁 随着基因组测序的发展袁2016 年贝莱斯芽孢杆菌重新获得细菌命名法中的地位17遥 近年来袁贝莱斯芽孢杆菌因在自然界中分布广尧生长快尧性能稳定尧对人类和动物无害且代谢产物丰富而受到重视袁 其在发酵食品中的作用及应用也备受关注遥 Jiang 等18通过分析红曲醋酿造过程中微生物动态变化与风味代谢物的相关性袁发现贝莱斯芽胞杆菌与醇类尧酯类风味物质呈强正相关曰He 等19向大曲中接种枯草芽胞杆菌和贝莱斯芽胞杆菌袁TTMP 和苯乙醇的含量显著增加袁改善了大曲风味特征遥本文以高盐稀态发酵酱醪中筛选的具有 TTMP 产生能力的贝莱斯芽孢杆菌 CS1.11 为出发菌株袁诱变并定向选育 TTMP 积累优势菌袁结合 TTMP 积累机理分析袁设计并优化其固态发酵条件袁以期获得 TTMP 积累高产株袁为酱醪发酵增进酱香及健康功能因子尧 实现酱油品质提升奠定基础遥1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种尧材料与试剂出发菌株院贝莱斯芽胞杆菌渊B.velezensis冤CS1.11袁分离自高盐稀态酱醪袁由湖南省调味品发酵工程技术研究中心 渊长沙理工大学分中心冤保藏曰炒麦尧豆粕袁取自湖南某酱油厂曰2-甲基-3-庚酮 渊色谱纯级冤袁 德国 Dr.Ehren鄄storfer 公司曰琢-萘酚渊分析纯级冤袁上海埃彼化学试剂有限公司曰无水肌酸渊98%冤尧乙偶姻渊97%冤尧四甲基吡嗪渊98%冤尧福林酚渊生化试剂冤袁上海麦克林生化科技有限公司曰L-酪氨酸渊生化试剂冤袁上海博奥生物科技有限公司曰其它试剂均为分析纯级袁购自国药集团化学试剂有限公司遥1.1.2培养基牛肉膏蛋白胨培养基尧LB 培养基尧葡萄糖蛋白胨水培养基配制参考文献20遥 酪素培养基配方如下院干酪素 4 g/L袁蛋白胨 10 g/L袁牛肉膏 3 g/L袁琼脂 20 g/L袁NaCl 5 g/L袁pH 7.0遥 固态发酵培养基配方如下院蒸煮豆粕 75 g袁炒麦 25g袁混匀后装入 250 mL 锥形瓶袁加入 25 mL 水袁自然 pH 值遥1.2仪器与设备722S 可见分光光度计袁上海仪电分析仪器有限公司曰ZWY-2102C 恒温振荡培养箱袁 上海智城分析仪器制造有限公司曰436GC/EVOQ TQ/PAL 三重四级杆气质联用仪袁 美国 Bruker Daltonics 公司曰DB-5MS 色谱柱袁美国 Agilent 公司曰50/30 滋mDVB/CAR/PDMS 固相微萃取针袁 美国 Supelco 公司遥1.3方法1.3.1产 TTMP 菌株的选育1.3.1.1诱变育种及产蛋白酶突变株筛选将菌种接种至 LB 液体发酵培养基中袁37 益尧180 r/min培养 14 h袁 取菌液用无菌生理盐水离心洗涤 3 次后制备成浓度为 108个细胞/mL 的菌悬液曰 吸取10 mL 菌悬液于功率 15 W 紫外灯下袁 距离 30 cm照射 90 s 后经梯度稀释涂布于酪素培养基平板上袁37 益培养 36 h袁挑选平板上水解圈与菌落直径比渊D/d 值冤大于 2.20 的突变株遥1.3.1.2乙偶姻优势突变株初筛将 D/d 值大于2.20 的突变株袁接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中袁37 益静置培养 48 h遥 培养结束后袁 取发酵液在4 000 r/min 下离心 10 min袁取上清液 0.4 mL 加入4.6 mL 显色试剂渊琢-萘酚 10 g/L袁无水肌酸 1 g/L袁氢氧化钠 40 g/L冤袁振荡混匀袁于 37 益条件下反应40 min袁以不接种的培养基为对照袁在波长 522 nm处测定吸光度袁选取吸光度大于 0.70 的菌株进入复筛遥1.3.1.3产 TTMP 优势突变株复筛将初筛得到的菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中袁37 益尧180r/min 摇床培养袁 制备成浓度为 108个细胞/mL 的菌悬液袁以接种量 2%接入固态发酵培养基中制曲72 h袁按曲颐盐水质量比为 1颐2 加入 167 g/L 盐水继续发酵 72 h袁 分别测定 TTMP 在制曲及盐卤发酵阶段的积累量遥1.3.2菌株性能测定按 1.3.1.3 节的方法将芽胞杆菌菌悬液接种于制曲培养基中袁37 益恒温培养 84 h袁分别取培养 12袁24袁36袁48袁60袁72袁84 h 的发酵样测定蛋白酶尧 淀粉酶活性和乙偶姻的积累量遥1.3.3单因素实验以制曲培养基为基础袁 接种量为 2%尧温度为 37 益尧搅拌次数为每日 1 次袁考176第 23 卷 第 8 期察炒麦添加量分别为豆粕质量的 40%袁50%袁60%袁70%袁80%时对 TTMP 积累量的影响曰以炒麦添加量为 50%袁 考察加水量分别为豆粕炒麦总质量的 10%袁20%袁30%袁40%袁50%时对 TTMP 积累量的影响曰以炒麦添加量为 50%尧加水量为 20%袁考察接种量分别为 2%袁4%袁6%袁8%袁10%时对TTMP 积累量的影响曰以炒麦添加量为 50%尧加水量为 20%尧 接种量为 8%袁 考察发酵温度分别为32袁36袁40袁44袁48 益时对 TTMP 积累量的影响曰以炒麦添加量为 50%尧 加水量为 20%尧 接种量为8%袁发酵温度为 40 益袁考察每日搅拌次数渊0袁1袁2袁3袁4 次冤对 TTMP 积累量的影响曰发酵时间均为72 h遥1.3.4响应面优化试验在单因素研究的基础上袁选取炒麦添加量尧加水量尧发酵温度 3 个因素为自变量袁以 TTMP 积累量为响应值袁应用 Box-Behnken 设计原理进行响应面优化试验袁 因素与水平编码见表 1遥1.3.5分析方法1.3.5.1蛋白酶活力测定蛋白酶活力参照 GB1886.174-2016 叶食品安全国家标准 食品添加剂食品工业用酶制剂曳21测定袁蛋白酶酶活计算公式如式渊1冤所示遥蛋白酶酶活渊U/g 干基冤=A伊K10伊4伊N伊11-W渊1冤式中院A要要要波长 680 nm 处测得的吸光度曰K要要要吸光常数袁97.91曰4要要要酶反应总体积袁mL曰N要要要稀释倍数曰10要要要反应时间袁min曰W要要要曲的水分百分含量袁61.65%遥1.3.5.2淀粉酶活力测定淀粉酶活性参照 3袁5-二硝基水杨酸渊DNS冤比色法测定22袁淀粉酶酶活计算公式如式渊2冤所示遥淀粉酶酶活渊U/g 干基冤=A伊N10伊K伊11-W渊2冤式中袁A要要要波长 540 nm 处测得的吸光度曰K要要要葡萄糖标准曲线斜率袁0.7994曰N要要要稀释倍数曰10要要要反应时间袁min曰W要要要曲的水分百分含量袁61.65%遥1.3.5.3乙偶姻的测定利用肌酸比色法测定乙偶姻占曲中干物质的含量23袁乙偶姻含量计算公式如式渊3冤所示遥乙偶姻含量渊g/kg 干基冤=AK伊N伊11-W渊3冤式中袁A要要要波长 522 nm 处测得的吸光度曰K要要要乙偶姻标准曲线斜率袁0.7994曰N要要要稀释倍数曰W要要要曲的水分百分含量袁61.65%遥1.3.5.4外标法测定 TTMP稀态发酵样过滤取滤液袁 固态发酵样加水稀释后过滤取滤液曰 取 2mL 滤液加入到 20 mL 顶空瓶中袁 调整 NaCl 质量浓度至 300 mg/mL袁 添加 5 滋L 质量浓度为 0.816滋g/滋L 的 2-甲基-3-庚酮作为内标物遥TTMP 标准曲线采取外标内标比的方法进行院以不同浓度 TTMP 标准品与内标物 2-甲基-3-庚酮峰面积之比为纵坐标袁TTMP 浓度为横坐标袁得到标准曲线的回归方程为院y=1.2663x-0.3991渊R2=0.9997冤遥 不同浓度 TTMP 标准品及发酵样品中 TTMP 的分析采用 SPME-GC-MS 进行袁SPME条件院振荡器 50 益袁将样品加热振荡 5 min袁吸附萃取 20 min袁 解析 5 min曰GC 条件院 进样口温度250 益袁程序升温袁40 益保持 4 min袁以 5 益/min 升温至 120 益袁 保持 2 min袁 再以 15 益/min 升温至230 益袁保持 4 min袁载气为高纯氦气袁流速为 1.2mL/min袁分流比为 10颐1曰MS 条件院EI 离子源遥 电子能量 70 eV袁 发射电流 200 滋A袁 离子源温度 250益袁质量扫描范围 m/z 30500遥2结果与讨论2.1出发菌株紫外诱变及初筛蛋白酶分泌能力强的菌株不仅能够促进发酵原料的降解袁提高原料利用率袁还能分解蛋白质产生氨基酸袁为 TTMP 氮杂环的形成提供氮素来源遥将紫外诱变处理后的悬液稀释涂布于酪素平板上袁酪素水解圈直径 D 与菌落直径 d 比值渊D/d冤越大表明菌株分解酪素的能力越强袁 蛋白酶活性越高遥 诱变处理后筛选出 218 株直径比渊D/d冤大于因素水平-101炒麦添加量渊A冤/%405060加水量渊B冤/%102030发酵温度渊C冤/益364044表 1试验因素水平表Table 1Experimental factors and levels table酱醪贝莱斯芽胞杆菌四甲基吡嗪高产菌的选育及其发酵优化177中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期菌株Strain图 1产 TTMP 突变株筛选结果Fig.1Screening results of TTMP-producing strainsCS1.11 的菌株袁以 D/d 值大于 2.20 为指标从中进一步挑选得到 47 株菌进行乙偶姻代谢能力测试遥乙偶姻是 TTMP 合成的前体物袁 在碱性条件下乙偶姻能与肌酸中的胍基作用产生粉红色的复合物袁颜色越深表明乙偶姻浓度越高24遥 将 47 株菌接入葡萄糖蛋白胨水培养基中袁 取发酵液加入显色剂袁利用分光光度计测得显色反应的吸光度袁结果如表 2遥 从表 2 可以看出袁突变株 7#尧23#尧24#尧32#尧33#吸光度大于 0.70袁说明这 5 株菌 TTMP 积累途径中关键物质要要要乙偶姻的积累较好袁有TTMP 积累的潜力袁因此袁选择这 5 株菌进入复筛遥2.2产 TTMP 菌株复筛酱油主要是以豆粕为蛋白原料袁 辅以炒麦为淀粉原料袁 经过制曲固态发酵阶段后加入盐水进行盐卤发酵压榨形成袁 为得到适用于酱油发酵体系的 TTMP 积累菌株袁将初筛所得的 5 株菌袁模拟酱油发酵袁 分别比较各菌株在制曲阶段和盐卤发酵阶段 TTMP 的积累量遥 如图 1 所示袁芽胞杆菌在制曲阶段 TTMP 的积累量高于盐卤发酵阶段袁这是由于盐水的加入导致发酵体系中溶氧量下降尧渗透压增加袁不利于芽胞杆菌的生长袁因此芽胞杆菌更适合用于制曲阶段积累 TTMP遥对各菌株在制曲阶段 TTMP 的积累量大小进行比较袁 菌株 23#的积累量小于出发菌株 CS1.11袁 说明该菌株降解原料的能力弱袁 不适合用于酱油发酵体系曰 菌株7#尧32#尧33#为 TTMP 积累能力较强的 3 株菌袁积累量分别达到了 546.45袁608.73袁737.57 mg/kg 干基袁较 CS1.11 提高了 32.53%袁47.64%袁78.89%袁具有应用于酱油发酵体系袁促进 TTMP 积累的潜力遥2.3突变株的性能发酵原料中的蛋白质及淀粉需经过蛋白酶尧淀粉酶的作用分解成氨基酸尧可发酵性糖等物质袁为菌体生长代谢提供营养袁 而经蛋白酶作用产生的氨基酸也是吡嗪环中氮元素的来源袁 淀粉酶作用产生的糖能经代谢能够形成乙偶姻袁 乙偶姻作为前体物直接参与了 TTMP 碳架的构成袁因此袁作为 TTMP 高产株应具有蛋白酶尧 淀粉酶活力强且在发酵过程中乙偶姻积累良好的特征遥 对复筛得到的突变株 7#尧32#尧33#制曲阶段蛋白酶尧 淀粉酶尧 乙偶姻随时间的变化进行考察袁 其结果见图2遥 由图 2a 可知袁发酵 60 h 时袁3 株菌的蛋白酶活性值达到最大袁 其中菌株 32#的蛋白酶活性值最高为 2 469.47 U/g 干基曰 由图 2b 可知 3 株菌的淀粉酶活性在发酵 72 h 时达到最大袁 其中菌株 32#菌株OD522nm菌株OD522nmCS1.110.11224#0.7191#0.16525#0.4212#0.07126#0.3153#0.07327#0.1344#0.09928#0.1545#0.24329#0.1856#0.19730#0.1287#0.89831#0.2638#0.23532#0.9189#0.06633#0.92810#0.10134#0.17711#0.12935#0.12912#0.17736#0.19713#0.08737#0.27714#0.15338#0.36015#0.14039#0.18516#0.12740#0.13317#0.09741#0.14918#0.19842#0.10519#0.14043#0.13520#0.12844#0.16021#0.48045#0.25222#0.14446#0.20223#0.73247#0.439表 2产乙偶姻突变株初筛结果Table 2Screening results of acetoin-producing strains178第 23 卷 第 8 期发酵时间Fermentation time/h渊a冤渊b冤渊c冤图 2突变株性能比较结果Fig.2The results of mutant strainsperformance comparison淀粉酶活性最高达到了 74.18 U/g 干基袁 菌株 32#在产淀粉酶和蛋白酶方面均有优势遥菌株 7#的蛋白酶尧 淀粉酶活性较低袁 使其在该发酵体系下TTMP 的积累量也低于其它菌株袁验证了将蛋白酶活性作为初筛依据的合理性遥 制曲阶段乙偶姻积累量随时间变化结果如图 2c 所示袁 发酵 36 h袁菌株 33#发酵产物中乙偶姻的积累量最高达到了43.79 g/kg 干基袁高于其它菌株发酵物中乙偶姻的积累量袁 这可能与葡萄糖合成乙偶姻途径上其它的关键酶活性有关袁如 琢-乙酰乳酸脱羧酶能催化乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻25遥 虽然菌株 33#的淀粉酶尧蛋白酶酶活性略低于菌株 32#袁但菌株 33#乙偶姻合成能力强袁 因此发酵物中 TTMP 的积累量高遥 突变株性能研究表明菌株 32#尧33#更适合用于酱油发酵体系作为 TTMP 的生产菌株袁 将其分别命名为 CS1.11-32尧CS1.11-33遥2.4酱醪贝莱斯芽胞杆菌 TTMP 发酵突变株固态发酵影响因素研究2.4.1炒麦添加量对 TTMP 积累的影响为了提高芽胞杆菌固态发酵过程中 TTMP 的积累量袁选取经诱变筛选得到的产 TTMP 优良菌株 CS1.11-32尧CS1.11-33袁以制曲培养基为初始培养基袁对固态发酵下影响 TTMP 生成的单因素进行研究遥 碳氮的组成能够影响代谢产物的流向袁 通过调整炒麦的添加量袁调节培养基的碳氮比组成袁由图 3 可知菌株 CS1.11-33 在炒麦添加量为豆粕量的 50%时袁TTMP 的积累量最大袁CS1.11-32 在炒麦添加量为 50%和 60%时 TTMP 积累量无显著差异遥 培养基的组成对芽胞杆菌的生长和 TTMP 的积累有着重要影响袁酱醪发酵体系中氮源的占比大袁从中筛选的芽胞杆菌能够适应高氮环境袁 而过高的蛋白水平会抑制菌株的生长袁 因此选择炒麦添加量为 50%遥2.4.2加水量对 TTMP 积累的影响培养基中水分含量会影响微生物的酶系作用及各类生化反应速率遥 如图 4 所示袁当加水量为 20%时袁菌株 CS1.11-32 和 CS1.11-33 TTMP 的积累量最高袁随着水分的增加 TTMP 的积累量逐渐降低遥 培养基中水分含量过低会造成许多生化反应的速率较低袁芽胞杆菌的生长和发酵活动较慢曰 适量的水分添加有助于原料中的蛋白发生一定程度的变性袁 淀粉糊化袁利于微生物分解利用袁过多的水分会造成原料黏稠结块袁 导致与氧气的接触面积变小低不利于发酵袁因此选择加水量为 20%遥2.4.3接种量对 TTMP 积累的影响接种量的大小能够影响原料初始发酵程度遥如图 5 所示袁接种量小于 6%时随着接种量增加袁TTMP 的积累量逐渐增加曰 菌株 CS1.11-33 的接种量 6%10%之间时 TTMP 积累量无显著差异袁 菌株 CS1.11-32 接酱醪贝莱斯芽胞杆菌四甲基吡嗪高产菌的选育及其发酵优化179中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期接种量Inoculation amount/%图 5接种量对 TTMP 积累的影响Fig.5The effect of inoculation amounton TTMP accumulation发酵温度Fermentation temperature/益图 6发酵温度对 TTMP 积累的影响Fig.6The effect of fermentation temperatureon TTMP accumulation炒麦添加量Roasted wheat addition amount/%注院不同小写字母表示差异性显著渊P约0.05冤袁下同遥图 3炒麦添加量对 TTMP 积累的影响Fig.3The effect of different roasted wheat additionamount on TTMP accumulation加水量Water addition amount/%图 4加水量对 TTMP 积累的影响Fig.4The effect of different water addition amounton TTMP accumulation种量在 6%8%时 TTMP 的积累量无显著差异遥 通常接种量越大袁种子液中包含的水解酶越多袁更利于基质的分解利用袁使菌体迅速增长袁而接种量过多容易移入代谢废物袁 综合考虑选择接种量为8%遥2.4.4发酵温度对 TTMP 积累的影响发酵温度会影响芽胞杆菌的生长代谢遥如图 6 所示袁当发酵温度从 32 益上升到 40 益时袁 随着发酵温度的升高菌株 CS1.11-32尧CS1.11-33 发酵产 TTMP 量也逐渐增加袁 温度达到 40 益时 TTMP 的积累量最大曰当发酵温度为 44 益时袁菌株 CS1.11-32 TTMP的积累量与发酵温度 40 益相比无显著差异袁而菌株 CS1.11-33 TTMP 积累量下降明显袁 说明菌株CS1.11-33 对温度较为敏感遥研究表明固态发酵条件下 TTMP 的生成分为 2 个阶段院 第 1 阶段在微生物作用下细菌分解底物产生 TTMP 的前提物质乙偶姻和氨袁 第 2 阶段由乙偶姻和氨自发反应形成 TTMP袁温度升高能促进该反应进行8袁26遥 适当提高发酵温度不仅有利于菌株生长尧 提升酶反应速率袁还能促进第 2 阶段的反应曰当温度过高时袁微生物细胞内酶系易因过热而失去活性袁TTMP 前体物的合成受到抑制袁导致积累量下降遥 因此袁选择发酵温度为 40 益遥180第 23 卷 第 8 期搅拌次数Stirring time图 7搅拌次数对 TTMP 积累的影响Fig.7The effect of stirring timeson TTMP accumulation2.4.5搅拌次数对 TTMP 积累的影响氧气的供应会影响菌种的生长及 TTMP 的生成27遥 通过调整搅拌次数能够调节发酵体系中的物料与氧气的接触袁结果如图 7 所示袁菌株 CS1.11-33 随着搅拌次数的增加 TTMP 积累量逐渐降低袁 说明随着搅拌次数的增加袁加速了乙偶姻和 TTMP 的挥发袁不利于 TTMP 的积累遥 菌株 CS1.11-32 TTMP 积累量随着搅拌次数的增加先增加后降低袁 且 TTMP的积累量低于前期发酵水平袁 这是由于该菌株发酵过程中生成了较多的 2袁3袁5-三甲基吡嗪袁消耗了前体物质袁搅拌次数的变化影响了菌株 CS1.11-32 的代谢方向遥CS1.11-33 在单因素实验中 TTMP的积累量一直高于菌株 CS1.11-32袁 且性能稳定袁并未因不搅拌影响菌体生长袁 同时还积累了较多的 TTMP袁因此袁更适合作为 TTMP 的生产菌袁该菌株在单因素优化后 TTMP 的最高积累量为 1838.48mg/kg 干基遥2.5酱醪芽胞杆菌 TTMP 固态发酵的响应面优化选取菌株 CS1.11-33袁以炒麦添加量渊A冤尧加水量渊B冤尧发酵温度渊C冤为自变量袁TTMP 积累量为响应指标袁 基于 Box-Behnken 设计三因素三水平试验 17 组袁结果见表 3遥对表 3 结果进行回归分析袁 得到回归方程为Y=1873.56-126.79A-24.30B-243.32C+6.11AB+80.27AC-331.75BC-147.22A2-108.23B2-441.53C2遥 对回归模型进行方差分析袁结果如表 4袁所得模型极显著渊P=0.00090.05冤袁说明模型拟合较好袁符合实际情况遥 一次项 C尧二次项 C2尧交互项 BC对 TTMP 积累量的影响极显著渊P0.01冤遥 一次项A尧二次项 A2对 TTMP 积累量的影响显著渊P0.05冤遥由图 8a 可知袁炒麦添加量与加水量对交互作用曲面的弯曲程度无明显差别袁 两者交互作用不显著遥图 8b 显示炒麦添加量一定时袁TTMP 积累量随着发酵温度增加呈先升高后降低的趋势袁 发酵温度的变化幅度大于炒麦添加量袁 说明发酵温度比炒麦添加量对 TTMP 的积累量影响大遥 图 8c 中等高线成椭圆形袁曲面图陡峭袁表明温度与加水量交互作用显著遥 对上述模型求极大值袁 得到菌株CS1.11-33 的最佳发酵产 TTMP 条件为炒麦添加量 44.08%尧加水量 28.85%尧发酵温度 37.35 益袁该条件下理论预测最大值为 1 980.94 mg/kg 干基袁依据实际情况调整最佳条件为炒麦添加量 44%尧加水量 29%尧 发酵温度 37 益进行 3 次验证试验袁得到 TTMP 平均积累量为 1 895.08 mg/kg 干基袁与理论值偏差 4.33%袁说明优化结果可靠袁响应面优化后的积累量约为单因素优化前的 2.6 倍遥试验号炒麦添加量渊A冤/%加水量渊B冤/%发酵温度渊C冤/益TTMP 积累量/mg 窑 kg-1干基11101 482.952-1-101 765.4931-101 373.8640001 846.9250-1-11 288.5360001 820.007-101981.24801-11 757.989-10-11 716.12100-111 553.11111011 014.03120001 882.58130002 000.2414011695.5515-1101 850.12160001 818.061710-11 427.83表 3响应面试验设计方案及结果Table 3Design and results for response surface analysis酱醪贝莱斯芽胞杆菌四甲基吡嗪高产菌的选育及其发酵优化181中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期TTMP 积累量TTMP accumulation/mg 窑 kg-1干基TTMP 积累量TTMP accumulation/mg 窑 kg-1干基A院炒麦添加量Roasted wheat addition amount/%A院炒麦添加量Roasted wheat addition amount/%渊a冤渊b冤方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型2 101 000.009233 400.0014.570.0009*A128 600.001128 600.008.030.0253*B4 723.6114 723.610.290.6040C473 600.001473 600.0029.560.0010*AB149.471149.470.010.9258AC25 772.60125 772.601.610.2452BC440 200.001440 200.0027.480.0012*A291 259.64191 259.645.700.0484*B249 323.41149 323.413.080.1228C2820 900.001820 900.0051.240.0002*残差112 100.00716 021.26失拟项89 362.35329 787.455.230.0719纯误差22 786.4945 696.62总和2 213 000.0016表 4回归模型方差分析Table 4Analysis of variance for regression model注院*表示差异显著渊0.01P0.05冤袁*表示差异极显著渊P0.01冤遥182第 23 卷 第 8 期TTMP 积累量TTMP accumulation/mg 窑 kg-1干基B院加水量Water addition amount/%渊c冤图 8各因子交互作用的等高线图和曲面图Fig.8Contour maps and surface maps for each factor interaction3结论本文以筛选自酱醪的贝莱斯芽胞杆菌 CS1.11为出发菌株袁经紫外诱变选育了 3 株突变株袁以酱油制曲工艺进行固态发酵复筛袁3 株菌 TTMP 积累量较 出发菌株 分别提高 了 32.53%袁47.64%袁78.89%袁 适合以酱油发酵原料为基础进行 TTMP积累遥3 株菌株 TTMP 积累相关基础发酵性能研究显示复筛中 TTMP 积累最优菌产乙偶姻能力强袁能为 TTMP 的形成提供充足的前体袁 将其命名为CS1.11-33曰TTMP 积累次优菌产蛋白酶尧淀粉酶能力强袁能促进发酵原料降解袁将其命名为 CS1.11-32曰2 株突变株均具有 TTMP 高产的潜力遥 对影响TTMP 积累的炒麦添加量尧加水量尧接种量尧发酵温度及搅拌次数进行 CS1.11-32 和 CS1.11-33 的对比发酵研究袁CS1.11-33 显示出更优的 TTMP 积累能力袁 以单因素实验为基础进行响应面试验优化得出 CS1.11-33 固态发酵积累 TTMP 的最佳发酵条件为院炒麦添加量 44%尧加水量 29%尧发酵温度37 益尧接种量 8%尧发酵过程中不进行搅拌袁在此条件下 TTMP 积累量最大达到 1 895.08 mg/kg 干基袁是其优化前的 2.6 倍袁 发酵物呈典型酱香香气袁说明突变株贝莱斯芽胞杆菌 CS1.11-33 具有应用于酱油发酵提升酱香风味的潜力遥 从酱醪中选育在酱油发酵体系中积累 TTMP 的优良菌株袁 在增强酱香风味的同时袁还能促进 TTMP 的功能性应用袁这将为提升酱油品质尧 推动酱油健康化发展提供了一条新的途径遥参考文献1MORTZFELD F B袁 HASHEM C袁 VRANKOVA K袁et al.Pyrazines院 Synthesis and industrial applicationof these valuable flavor and fragrance compoundsJ.Biotechnology Journal袁 2020袁 15渊11冤院 2000064.2GUO M袁 LIU Y袁 SHI D Z.Cardiovascular actionsand therapeutic potential of tetramethylpyrazine 渊ac鄄tive component isolated from Rhizoma Chuanxiong冤院Roles and mechanismsJ.BioMed Research Interna鄄tional袁 2016袁 2016院 2430329.3GAO H J袁 LIU P F袁 LI P W袁 et al.Ligustrazinemonomer against cerebral ischemia/reperfusion injuryJ.Neural Regeneration Research袁 2015袁 10 渊5冤院832-840.4ZHAO X X袁 LIU Y H袁 SHU L袁 et al.Study onmetabolites of Bacillus producing soy sauce-like aro鄄ma in Jiang-flavor Chinese spiritsJ.Food Science&Nutrition袁 2020袁 8渊1冤院 97-103.5王瑞袁 彭晓光袁 黄登宇.食醋中川芎嗪成分研究进展J.中国调味品袁 2015袁 40渊6冤院 137-140.WANG R袁 PENG X G袁 HUANG D Y.Researchprogress of tetramethylpyrazine in vinegarJ.ChinaCondiment袁 2015袁 40渊6冤院 137-140.6LIU Y袁 SU H袁 SONG H L.Comparison of four ex鄄tractionmethods袁SPME袁DHS袁SAFE袁VersusSDE袁 for the analysis of flavor compounds in Natto酱醪贝莱斯芽胞杆菌四甲基吡嗪高产菌的选育及其发酵优化183中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期J.Food Analytical Methods袁 2018袁 11渊2冤院 343-354.7丁海龙袁 敖灵袁 邓波袁 等.中国白酒微量健康成分分析J.中国酿造袁 2018袁 37渊2冤院 11-14.DING H L袁 AO L袁 DENG B袁 et al.Analysis oftrace healthy components of Chinese BaijiuJ.ChinaBrewing袁 2018袁 37渊2冤院 11-14.8吴建峰袁 徐岩.白酒细菌酒曲固态培养条件下 B.subtilis S12 产四甲基吡嗪的合成机制J.食品与生物技术学报袁 2014袁 33渊1冤院 8-15.WU J F袁 XU Y.Formation mechanism of tetram鄄ethylpyrazine produced with B.subtilis S12 under thefermentation condition simulated bacterial Qu prepa鄄ration used for Chinese liquor brewingJ.Journal ofFood Science and Biotechnology袁 2014袁 33渊1冤院 8-15.9BESSONI袁CREULYC袁GROSJB袁etal.Pyrazine production by Bacillussubtilisin solid-state fermentation on soybeansJ.Applied Microbiol鄄ogy and Biotechnology袁 1997袁 47渊5冤院 489-495.10ZHU B F袁 XU Y袁 FAN W L.High-yield fermenta鄄tivepreparationoftetramethylpyrazinebyBacillussp.using an endogenous precursor app