高效液相色谱法测定肝复颗粒中6种成分含量.pdf

1医疗装备 2024 年 3 月第 37 卷第 5 期 Medical Equipment,March.2024,Vol.37,No.5肝复颗粒是一种中成药，主要由虎杖、冷水花、吉祥草、苦参、黄柏、丹参、栀子等 7 味药材组成,具有疏肝利胆、活血化瘀、清热解毒等功效，主要用于治疗气滞血瘀、肝胆湿热所致的急慢性肝炎。方中虎杖的主要成分为虎杖苷和大黄素，具有护肝的作用1-2；栀子的有效成分为栀子苷和西红花苷类，具有保肝、抗癌等作用3-4；丹参中丹参酮类成分主要具有保护肝脏、抗菌消炎的作用5-6。中国药典7的原有标准收载中记载了栀子苷的定量限定，但是关于其他成分测定的相关研究较少。研究证实，复方中药成分复杂，其疗效高效液相色谱法测定肝复颗粒中 6 种成分含量吴国军，徐惠玲，龚艳珍（通信作者）江西省人民医院（江西南昌330006）摘要目的建立高效液相色谱法（HPLC）法，同时测定肝复颗粒中栀子苷、西红花苷、丹参酮、隐丹参酮、虎杖苷、丹参酮 A 6 种成分的含量。方法采用COSMOSILC18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸为流动相，流速为 0.8 ml/min，进行梯度洗脱，检测波长为 205 nm。结果6 种成分均实现较好的分离，在一定的浓度范围内各成分均呈良好的线性关系，平均回收率为 97.92%99.67%，相对标准偏差（RSD）为 0.28%1.51%。定量数据经统计学软件分析，可知栀子苷和西红花苷是影响批次样品差异的主要因素。结论建立 HPLC 法同时测定肝复颗粒中栀子苷、西红花苷、丹参酮、隐丹参酮、虎杖苷、丹参酮A 6 种成分的含量，有利于对肝复颗粒成分的质量控制。关键词肝复颗粒；6 种成分；含量测定；高效液相色谱法中图分类号R284.1 文献标识码A 文章编号1002-2376（2024）05-0001-05DOI10.3969/j.issn.1002-2376.2024.05.001基金项目：江西省中医药管理局科技计划（2022B1056）收稿日期：2023-03-16论著 Determination of Six Components in Ganfu Granules by High Performance Liquid ChromatographyWu Guojun,Xu Huiling,Gong Yanzhen(Corresponding Author).Jiangxi Provincial Peoples Hospital,Nanchang Jiangxi 330006,China【Abstract】ObjectiveTo establish a high-performance liquid chromatography(HPLC)method for the simultaneous determination of six components in Ganfu granules,including geniposide,crocin,tanshinone,cryptotanshinone,polygonatum cuspidatum glycoside,and tanshinone A.MethodsUsed a COSMOSILC18 chromatographic column,with acetonitrile 0.1%phosphoric acid as the mobile phase and a flow rate of 0.8 ml/min,for gradient elution with a detection wavelength of 205 nm.ResultsSix components all achieved good separation,and within a certain concentration range,each component showed a good linear relationship.The average recovery rate was from 97.92%to 99.67%,and the RSD was from 0.28%to 1.51%.Quantitative data was analyzed by statistical software,and it was found that geniposide and crocin were the main factors affecting the differences in batch samples.ConclusionEstablishing a high-performance liquid chromatography(HPLC)method to simultaneously determine the content of six components in Ganfu granules,including geniposide,crocin,tanshinone,cryptotanshinone,polygonatum cuspidatum glycoside,and tanshinone A,is beneficial for the quality control of Ganfu granules.【Key words】Ganfu Granules;6 components;Content determination;High performance liquid chromatography2医疗装备 2024 年 3 月第 37 卷第 5 期 Medical Equipment,March.2024,Vol.37,No.5由方中药材独立或相互作用决定，各药材所占比例将影响整个药方的疗效7-10。因此，评价复方中药的疗效需多成分测定。本研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定肝复颗粒中 6 种成分（虎杖苷、西红花苷、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮 A、栀子苷）的含量，以期全面、客观地评价肝复颗粒的药效成分，现报道如下。1 仪器与试剂1.1 仪器高效液相色谱仪（山东鲁创分析仪器股份有限公司，型号：LC-500）；高精度电子天平（上海赞维衡器有限公司，型号：ZA505AS）；恒温水浴锅（常州国宇仪器有限公司，型号：HH-s6）；数控超声波清洗器（北京东南仪诚实验室设备有限公司，型号：KQ5200DV）。1.2 药品与试剂对照品栀子苷（批号：110749-201919）、虎杖苷（批号：111575-201603）、隐丹参酮（批号：110852-201807）、丹 参 酮（批 号：110867-201607）、丹参酮 A（批号：110766-202022）均购自中国食品药品检定研究院，西红花苷（上海泽叶生物科技有限公司，批号：ZY67302SD），色谱纯乙腈（上海优试化工有限公司，批号：20200322），色谱纯甲醇（广州浩盈化工科技有限公司，批号：20200310）。肝复颗粒共 12 批，生产厂家为贵州君之堂制药有限公司（批次分别为：200201、200202、200203、200204、020401、200402、200403、200404、200701、200702、200703、200704）。2 方法与结果2.1 色谱条件色 谱 柱：COSMOSIL C18（150 mm4.6 mm，4.6 m）。流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）。以 0.8 ml/min 流速梯度洗脱（010 min，A：2%16%；1015 min，A：16%16%；1520 min，A：16%50%；2023 min，A：50%70%；2326 min，A：70%2%；2630 min，A：2%），检测波长为 205 nm，柱温为 40，进样量为 10 l。2.2 配制对照溶液同一 25 ml 容量瓶中放入适量的虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮A、西红花苷、栀子苷为对照品，加甲醇溶解制成每毫升含虎杖苷0.28 mg、隐丹参酮 0.36 mg、丹参酮 0.44 mg、丹参酮A 0.14 mg、西红花苷 0.22 mg、栀子苷 0.12 mg 的混合溶液，备用。2.3 配制供试品溶液取肝复颗粒研磨成均匀细粉，称量 0.5 g，放入具塞锥形瓶中，添加色谱纯甲醇溶解，称定质量，超声（功率为250 W，频率为40 kHz）提取30 min取出、放冷，加色谱纯甲醇补足质量，摇匀，经0.45 m 微孔滤膜过滤后得所需滤液。2.4 配制阴性供试品溶液按照颗粒制备工艺，分别制备小样虎杖、丹参及栀子阴性颗粒，并按“2.3”方法分别制备阴性溶液。注：1 为栀子苷，2 为西红花苷，3 为丹参酮，4 为隐丹参酮，5 为虎杖苷，6 为丹参酮A图 1各样品高效液相色谱图2.5 方法学2.5.1 线性试验采用甲醇按比例稀释“2.2”中混合对照品储备液，分别稀释 2、10、50、100 倍。按色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算对照品的回归方程及相关系数，见表 1。3医疗装备 2024 年 3 月第 37 卷第 5 期 Medical Equipment,March.2024,Vol.37,No.5表 16 种成分的线性关系 成分回归方程r线性范围（g/ml）栀子苷Y=11 024.7492X-8 120.84310.99831.20120西红花苷 Y=21 069.2743X-20 308.4598 0.99962.20220丹参酮Y=5 776.1354X-3 051.86070.99954.40440隐丹参酮Y=5 419.2013X+433.78650.99993.60360虎杖苷Y=8 940.7712X-772.62220.99992.80280丹参酮AY=5 691.0708X+3 511.03050.99981.401402.5.2 精密度试验根据“2.1”方法色谱条件将混合对照品连续进样 6 次，记录峰面积、保留时间，虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮 A、西红花苷、栀子苷的相对标准偏差（relative standard devition，RSD）分别为 0.22%、0.42%、0.83%、0.17%、0.31%及 0.24%，表明仪器精密度良好。2.5.3 重复性称量 6 份颗粒粉末，按供试品制备方法制得样品 6 份，根据“2.1”方法色谱条件测定，记录保留时间、峰面积，计算虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮A、西红花苷、栀子苷的平均含量分别为 1.7427、1.3941、1.2448、0.7967、0.4481 mg/g，RSD 分别为 1.31%、0.26%、1.55%、0.38%、1.31%及 0.25%，表明该方法重复性良好。2.5.4 稳定性根据“2.1”方法色谱条件分别对制备后 0、2、4、8、12、24 h 试品溶液进行测定，记录峰面积、保留时间，计算虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮A、西红花苷、栀子苷的RSD分别为0.34%、1.28%、1.37%、0.61%、1.28%及 1.23%，表 明 供试品溶液 24 h 内稳定性良好。2.5.5 加样回收率在具塞锥形瓶中放入已知含量的样品 0.5 g，6 份，按 100%加入 6 个对照品，按照“2.3”实验方法制成供试品溶液，测定溶液中成分的含量并计算回收率，同时以溶液检测时的信噪比 S/N 3 作为最低检测限，见表 2。2.5.6 系统适应性参照中国药典7 2015 年版第 4 部“0512 高效液相色谱法”中系统适应性试验进行考察，结果其柱效、分离度、灵敏度、重现性等均符合规定，故可用于含量测定。2.6 样品含量测定取 12 批次样品，分别按“2.3”方法制备供试品溶液各 3 份，每个溶液按“2.1”色谱条件进样测定 2 次，记录峰面积，并按外标法计算虎杖苷、西红花苷、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮 A、栀子苷的含量，见表 3。表 2加样回收率结果原有量（mg）加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）最低检测限栀子苷0.22510.23000.4561100.440.22480.23000.4601102.300.22530.23000.452398.6999.611.512.47 ng0.22470.23000.452899.180.22530.23000.451898.460.22430.23000.451198.60西红花苷0.40020.40000.8002100.000.39970.40000.8001100.100.40060.40000.798899.5599.020.990.03 mg0.39950.40000.791598.010.40070.40000.792697.980.39880.40000.792798.47丹参酮0.62530.63001.2561100.130.62450.63001.253699.850.62590.63001.250199.0899.610.442.14 ng0.62410.63001.250399.390.62600.63001.251199.220.62310.63001.253199.99隐丹参酮0.70030.70001.400199.980.69940.70001.395899.480.70100.70001.395499.2199.670.412.23 ng0.69900.70001.396799.670.70110.70001.396699.360.69790.70001.4000100.30虎杖苷0.87540.88001.7562100.100.87430.88001.750299.530.87620.88001.751199.4299.630.280.02 mg0.87380.88001.751299.710.87640.88001.750399.310.87240.88001.750199.74丹参酮A0.20010.20000.396498.170.19980.20000.395697.890.20030.20000.395897.7797.920.432.56 ng0.19970.20000.395697.950.20030.20000.394897.250.19940.20000.396498.51注：RSD 为相对标准偏差2.7 数据分析将表 3 中的定量数据采用 SIMCA 13.0 软件进行主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）分析，结果如图 2 所示，12 个批次的肝复颗粒分为 3 类，通过不同月份的生产批次区分，其成分含量差异与不同月份颗粒样品的相对应。此外，定量数据经 SPSS 的聚类分析和因子分析后，结果见图 3，12 批次的颗粒样品可分为 3 类，均与月份样品相对应。此结果与 PCA 的分析一致。4医疗装备 2024 年 3 月第 37 卷第 5 期 Medical Equipment,March.2024,Vol.37,No.5因子分析中，以特征值 1，方差贡献率 80%为标准，发现成分 1 和 2 为主要的影响成分。由碎石图和方差累积值（表 4）可知，栀子苷和西红花苷是影响差异的主要成分。表 312 个批次含量测定结果（mg/g）编号批次栀子苷西红花苷丹参酮 隐丹参酮 虎杖苷 丹参酮AS12002010.448 0.7971.2491.3941.7430.398S2200202 0.44320.7831.2541.3741.7230.382S3200203 0.42390.7941.2231.3841.7230.373S4200204 0.42310.8031.3441.3831.7450.374S5200401 0.52370.6532.3341.4342.3540.512S6200402 0.53430.6432.3431.4222.3440.523S7200403 0.53320.6582.3351.4112.2350.532S8200404 0.51230.6502.4341.4322.2550.533S9200701 0.54320.7031.4320.9461.2451.123S10200702 0.50230.7031.4330.9221.2111.145S11200703 0.50330.6961.4310.9341.2541.122S12200704 0.50120.7121.4220.9421.2341.153注：PCA 为主成分分析，OPLS-DA 为正交偏最小二乘判别分析图 2PCA 和 OPLS-DA 分析结果3 讨论本实验同时测定肝复颗粒中 6 种成分，将乙腈作为有机相是由于色谱峰的基线平稳和洗脱；选择水相流动相时，加入磷酸，在一定程度上可以调节峰的平滑度和峰形的对称性。由于磷酸具有一定黏度，因此选择柱温为 40、流速为 0.8 ml/min，以便溶剂流动相良好。在选择上述参数的情况下，整个系统柱压运行平稳，说明此提取条件可行。因待测化合物具有不同的最大吸收波长，逐一选择最大吸收波长对后期计算不便，因此综合考虑选择 205 nm 为检测波长，各化合物有一定的吸收强度。配制样品时，需考察不同浓度溶剂对提取效果的影响，发现采用 70%甲醇作为提取溶剂时，各组分的含量处于一个整体，较其他溶剂（水、乙醇、50%甲醇、70%乙醇等）提取水平高。图 3聚类分析和因子分析结果 表 4解释的总方差成分初始特征值合计方差百分比（%）累计（%）13.17852.960 52.96022.74245.703 98.66330.067 1.117 99.78040.009 0.152 99.93250.003 0.052 99.98460.001 0.016100.00成分提取平方和载入合计方差百分比（%）累计（%）13.17852.96052.96022.74245.70398.6633456本实验测定结果显示，不同批次的 6 种成分存在一定的差异，如丹参酮、虎杖苷在不同批次中含量差异波动 50%，可能是由于生产投料时原药材含量质量差异所致，因此在选择原药材时，应规范药材产区，以维持成分含量的平稳。且定量数据经软件（下转第 8 页）8医疗装备 2024 年 3 月第 37 卷第 5 期 Medical Equipment,March.2024,Vol.37,No.5确获得 CO 值，且有效检测出二尖瓣、三尖瓣和主动脉瓣膜的狭窄或关闭不全情况。参考文献1 葛洪波.彩色多普勒超声心动图诊断慢性风湿性心脏瓣膜病的临床价值研究 J.影像研究与医学应用，2022，6（13）：158-160.2 张微，崔玉莹.风湿性心脏瓣膜病的心脏彩超表现及诊断分析 J.医学理论与实践，2021，34（12）：2118-2120.3 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