结直肠癌细胞WS480中硫化氢和生物硫醇的检测与成像研究 (1).pdf

基金项目:江苏省自然科学基金面上项目(BK20211059);江苏省大学生创新创业课题重点项目(202310313046Z)通信作者,E-mail:xuzhou #同等贡献结直肠癌细胞 WS480 中硫化氢和生物硫醇的检测与成像研究王元凡1#,刘天乐1#,缪林熠2,任晔潼1,陈俊凝3,张胜香3,徐洲3,4(1.徐州医科大学第一临床医学院,江苏 徐州 221004;2.徐州医科大学口腔医学院;3.徐州医科大学药学院;4.徐州医科大学公共实验研究中心)摘要:目目的的 旨在设计、合成一种新型荧光探针,用于结直肠癌细胞中生物硫醇和硫化氢的检测与成像,期望为结直肠癌的早期诊断提供新工具和新方法。方方法法 设计的探针 WZL-1 通过 4 步反应从商业易得的廉价原料合成而得,并对其光学性能、细胞毒性以及活细胞荧光成像进行了详细评价。在评价中,考虑了探针的荧光特性、对生物硫醇和硫化氢的敏感性,以及其在活细胞成像中的适用性。结结果果在生理条件下探针 WZL-1 对生物硫醇半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢在 630 nm 处的发射强度均显著增强。探针表现出卓越的灵敏度,在仅需 30 s 的极短时间内,WZL-1 能够迅速准确地检测目标分子,且荧光强度至少可以维持 50 min。WZL-1 荧光探针的线性范围广泛,其对 GSH 的检测线低至 554 nm,探针在 0 30 mol/L 浓度范围内细胞存活率超过90%。结结论论 荧光探针 WZL-1 能与结直肠癌细胞 WS480 内的生物硫醇和硫化氢发生特异性反应,并释放出红色荧光信号,而其他物质分子则不与其反应,其可用于细胞中各种生物硫醇和硫化氢的实时监测与成像。关键词:结直肠癌;硫化氢;生物硫醇;荧光探针;检测限;谷胱甘肽中图分类号:R587.1 文献标志码:A 文章编号:2096-3882(2024)03-0157-06DOI:10.3969/j.issn.2096-3882.2024.03.001Detection and imaging of hydrogen sulfide and biological thiols in colorectal cancer WS480 cellsWANG Yuanfan1#,LIU Tianle1#,MIAO Linyi2,REN Yetong1,CHEN Junning3,ZHANG Shengxiang3,XU Zhou3,4(1.First School of Clinical Medicine,Xuzhou Medical University,Xuzhou,Jiangsu 221004,China;2.School of Stomatology,Xuzhou Medical University;3.School of Pharmacy,Xuzhou Medical University;4.Public Experimental Research Center,Xuzhou Medical University)Abstract:Objective To design and synthesize a novel fluorescent probe for the detection and imaging of biothiols and hydrogen sulfide in colorectal cancer cells,with the expectation of providing new tools and methods for the early diag-nosis of colorectal cancer.Methods The designed probe,WZL-1,was synthesized from commercially available and in-expensive raw materials through a four-step reaction.Its optical properties,cytotoxicity,and fluorescence imaging in liv-ing cells were evaluated in detail.The probes fluorescence characteristics,sensitivity to biothiols and hydrogen sulfide,and its suitability for live cell imaging were analyzed.Results Under the physiological conditions,the probe WZL-1 ex-hibited significantly enhanced emission intensities at 630 nm for thiols cysteine,homocysteine,glutathione,and hydrogen sulfide.The probe demonstrated excellent sensitivity,and rapidly and accurately detected target molecules within a short period of time of 30 s,with fluorescence intensity maintained for at least 50 min.The WZL-1 fluorescence probe had a wide linear range,with a detection limit as low as 554 nm for GSH.The cell survival rate was more than 90%over the concentration range of 0-30 mol/L.Conclusions The fluorescent probe WZL-1 can specifically react with bio thiols and hydrogen sulfide in colorectal cancer WS480 cells,emitting red fluorescence signals,while other substances do not react.It can be used for real-time monitoring and imaging of various biothiols and hydrogen sulfide in cells.Key words:colorectal cancer;hydrogen sulfide;biothiols;fluorescent probe;detection limit751徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)结直肠癌(CRC)是一种常见的恶性肿瘤,多数患者在确诊时已属于中晚期,具有高发和高死亡率的特点1-3。目前,尽管以肠镜为主流的 CRC 诊断手段取得了显著成功,但由于其侵入性和不适用于所有人群,故依然存在一些潜在的限制。在我国CRC 的发病率农村远高于城市,包括部分人群可能因为身体原因、检查价格或个人抵触情绪而不愿接受这种检测方式。因此发展更多温和的、非侵入式的结直肠癌检测方法仍有必要。近年来,研究表明硫化氢(H2S)和生物硫醇在CRC 的发生和发展中扮演着重要的角色,这类小分子在调节细胞信号传导、维持细胞内稳态等生物学过程 中 发 挥 着 关 键 作 用4-5。例 如,谷 胱 甘 肽(GSH)稳态的改变对细胞生理学具有深远的影响,并且已证明 GSH 缺乏与癌症、肝损伤和神经退行性疾病有关6-7。肿瘤部位半胱氨酸(Cys)的浓度异常,明显高于正常组织,甚至可以反映肿瘤进展的不同阶段8。H2S 作为最简单的巯基类化合物,在维持细胞内氧化还原稳态和正常生命活动中起着至关重要的作用,其在肠道中的生理学作用及其在肠道疾病中的病理机制是近年来的研究热点之一9-13。研究显示,H2S 在炎症性肠病14和 CRC15的发生发展中扮演着重要的作用。全面跟踪细胞和生物体内生物硫醇和硫化氢水平对于诊断和治疗肿瘤等疾病至关重要,对结直肠癌患者体内硫化氢和生物硫醇的快速、准确检测具有重要的临床意义。生物体内生物硫醇和硫化氢的有效检测方法对于深刻理解其生理和病理作用具有重要意义,而荧光探针因其灵敏度高、选择性好、可视性强、细胞损伤小等优点,已成为当前医学生命科学领域不可或缺的检测手段之一。目前,尽管能够同时检测硫化氢、半胱氨酸/同型半胱氨酸和 CRC 的荧光探针已有文献报道16-24,但大多数探针缺乏全面检测总生物硫醇和硫化氢的能力,大多数探针仅能检测其中的 2 种或者 3 种。此外,这些探针的最大发射波长较短,可能导致其与细胞和组织中的生物材料的背景发射产生干扰,导致灵敏度降低。因此,对于开发长波长发射和较大斯托克斯位移的探针仍有需求。1 材料和方法1.1实验试剂DMEM 高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司);胎牛血清(澳洲 Gibco 公司);CCK8 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒;WZL-1 溶解在二甲基亚砜(DMSO)中制备储备液(1.0 mmol/L)。将硫化氢钠(NaHS)溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS 缓冲液,pH 7.4)中,得到 H2S 储备液(10.0 mmol/L)。环戊酮、三溴化磷(PBr3)、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、碳酸铯(Cs2CO3)、三溴化硼(BBr3)、吡啶、丙烯腈、2,4-二硝基氟苯、NaHS 和 N-乙基马来酰亚胺(NEM)等试剂以及半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽等氨基酸为商业购买。1.2 仪器设备 使用 JEOL ECZ400 NMR 谱仪记录核磁共振数据,使用 Bruker Autoflex MALDI-TOF 质谱仪收集高分辨质谱数据,Agilent CARY 60 UV-Vis 分光光度计记录吸收光谱数据,使用 Hitachi F-7000 荧光分光光度计测量荧光光谱数据。利用Leica Application Suite X(LAS X)获得细胞荧光的共聚焦显微镜图像。使用 PHS-3C 数字 pH 计测定pH 值。1.3 实验方法1.3.1 细胞培养 WS480 细胞来源于中国科学院细胞库,并在高葡萄糖 DMEM 培养基中添加 10%胎牛血清,在 37 的 5%CO2环境中培养。使用 CCK-8 试验评估探针 WZL-1(030 mol/L)对细胞的活力。WS480 细胞分为 3 组:A 组作为实验组,先用硫醇清除剂 NEM(1 mmol/L)孵育 60 min,然后与GSH(100 mol/L)(代表生物硫醇)孵育 30 min,最后与 WZL-1(10 mol/L)孵育 30 min 后进行成像;B 组为空白对照组,细胞先用硫醇清除剂 NEM(1 mmol/L)孵育 60 min,然后再加入 WZL-1(10 mol/L)孵育 30 min 后进行成像;C 组为对照组,与WZL-1(10 mol/L)孵育 30 min 使用共聚焦激光扫描显微镜进行成像。1.3.2 探针合成与结构表征 设计的探针 WZL-1可以从商业易得的廉价原料经过 5 步反应得到25,总产率 12%(图 1)。其结构经核磁共振波谱和高分辨质谱确认。2 结果与讨论2.1 探针响应机制探针 WZL-1 本身是不发荧光的,在与生物硫醇或硫化氢反应后,释放出荧光母核,从而引发红色荧光开启响应。该探针既能与外源性硫醇也可以与结肠癌细胞内的生物硫醇或硫化氢发生特异性反应,并释放出红色荧光信号(图 2)。851徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)探针 WZL-1:红色固体。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)9.13(s,1H),8.61(dd,J=8.7,2.3 Hz,1H),8.30(d,J=8.7 Hz,1H),7.91(s,1H),7.51(d,J=8.6 Hz,1H),7.29(d,J=2.3 Hz,1H),7.20(s,1H),7.08(dd,J=8.5,2.4 Hz,1H),2.98-2.95(m,2H),2.91-2.88(m,2H).13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)162.8,151.8,151.6,148.3,148.1,147.6,139.7,133.7,130.4,128.9,127.6,124.4,122.2,121.2,119.0,116.2,115.2,114.8,110.4,70.5,24.9,24.7.HRMS(ESI-)m/z:Calcd for C22H12N4O8S M-H-:491.0303;found:491.0324 图 1 探针 WZL-1 的合成路线图 2 探针响应机制2.2 探针对硫醇和硫化氢的选择性响应探针的一个重要特征在于其对特定分析物相较于其他物质具有特殊的选择性。为了研究探针 WZL-1 特异识别能力,我们使用紫外-可见和荧光分光光度计进行了实验。图 3 展示了在 DMSO PBS 缓冲液(10 mmol/L,pH 7.4,1 9,V/V)中添加各种分析物(各10 当量)后的紫外-可见和荧光光谱的变化,包括 l-丙氨酸(Ala)、l-精氨酸(Arg)、l-天冬氨酸(Asp)、l-谷氨酰胺(Gln)、l-谷氨酸(Glu)、l-甘氨酸(Gly)、l-组氨酸(His)、l-异亮氨酸(Ile)、l-亮氨酸(Leu)、l-赖氨酸(Lys)、l-蛋氨酸(Met)、l-苯丙氨酸(Phe)、l-脯氨酸(Pro)、l-丝氨酸(Ser)、l-苏氨酸(Thr)、l-色氨酸(Trp)、l-酪氨酸(Tyr)、l-缬氨酸(Val)等。探针对它们基本没有响应,而 Cys 则在 630 nm 处的荧光发射强度显著增强(41 倍)。分别向 WZL-1 探针溶液中加入 Hcy、GSH 和 NaHS,在 630 nm 处的发射强度均显著增强(分别为 35 倍、29 倍、41 倍)。以上结果说明该探针可用于生物硫醇和 H2S 的选择性检测。1.Na2S2O3;2.Na2S2O5;3.Na2S2O4;4.NaCNS;5.HPO42-;6.H2PO4-;7.Ca2+;8.K+;9.Br-;10.F-;11.NO3-;12.Cl-;13.Ser;14.Lys;15.Gly;16.His;17.Asp;18.Tyr;19.Phe;20.Thr;21.Met;22.Trp;23.Cys;24.GSH;25.Hcy;26.NaHS;27.Blank图 3 探针对硫醇和硫化氢的选择性响应951徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)2.3 浓度依赖性与检测限 为了研究探针 WZL-1对生物硫醇的检测限,将探针 WZL-1(10 mol/L)与不同浓度的 GSH 处理。结果见图 4(缝隙:5 nm/5 nm)。图 4 探针浓度依赖性与检测限 数据分析表明 GSH 在 010 mol/L 浓度范围内,相对于 630 nm 处的荧光强度存在着明确的线性关系,这表明探针 WZL-1 对 GSH 的检测呈现出可靠的浓度依赖性,其对 GSH 的检测限为 554 nmol/L,说明探针 WZL-1 在生物硫醇检测方面具有高灵敏度。2.4 pH 值影响 由于荧光探针的设计旨在用于活细胞中生物硫醇和硫化氢的检测应用,因此评估 pH值对其检测性能的影响显得尤为重要。在存在生物硫醇/H2S(100 mol/L)的情况下,探针 WZL-1 的荧光强度在 pH 6 到 10 的范围内呈现出明显的变化(图 5)。值得注意的是,在生理和碱性条件下,探针WZL-1 对于 GSH 显示了较强的荧光强度。这些结果表明,探针 WZL-1 对于生物硫醇和硫化氢的检测受到环境 pH 的显著调控。此外,在不同 pH 条件下,荧光强度的变化可能反映了生物硫醇和硫化氢在细胞内的动态变化。这对于理解这些生物分子在不同生理条件下的行为具有重要意义。2.5 时间依赖性在 GSH 浓度为 100 mol/L 的条件下,研究了探针 WZL-1 的荧光光谱随时间变化的情况(图 6)。值得注意的是,探针在大约 25 s对 GSH 显示了较强的荧光响应,在 125 min 内达到最大荧光强度,并且在 50 min 内荧光强度保持稳定。这些结果体现了探针 WZL-1 对于 GSH 的时间依赖性响应特征,探针在较短时间内迅速响应GSH,显示出较快的动力学特性;而在较长时间尺度上,其荧光信号达到峰值,并在一定时间内维持相对稳定的水平,对理解探针在实时监测生物硫醇的应用以及在不同时间点的适用性具有重要意义。图 5 pH 值对探针性能影响2.6 细胞培养和细胞毒性测试在进行细胞成像实验之前,了解探针的毒性对于确保实验结果的可靠性和生物样本的实际应用价值至关重要。针对探针 WZL-1 的细胞存活性分析,采用 CCK-8 法检测。SW480 细胞被悬浮在含有 10%FBS 的 DMEM培养基中,以 37、5%CO2的环境培养。细胞附着到孔中后,分别向细胞培养基中加入不同浓度(0、5、10、15、20、25、30 mol/L)的 WZL-1 探针溶液,培养细胞 24 h。然后向每个孔中加入 CCK-8 溶液,并在细胞培养箱中培养 1 h。在发生颜色变化后,使用微板读数器在 450 nm 处测量光密度值。结果表明探针在 030 mol/L 浓度范围内细胞存活率超过 90%,探针基本没有毒性,可以进行后续细胞成像研究。061徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)2.7 活细胞荧光成像 WS480 细胞分为 3 组进行成像。实验结果显示,A 组呈现明显的红色荧光,B组无荧光,C 组与 A 组一样,呈现红色荧光(图 7)。上述结果表明,探针 WZL-1 具有良好的细胞膜渗透性,能够检测细胞内生物硫醇。它还能检测外源添加的生物硫醇,适用于活细胞中硫醇的标记,这为其在相关癌症的诊断和手术导航方面的应用提供了可能。图 6 时间依赖性研究图 7 探针与结直肠癌 SW480 中生物硫醇的响应与成像 综上所述,本研究设计并成功合成了一种新型荧光探针 WZL-1,用于结直肠癌细胞中生物总硫醇和硫化氢的检测与成像。WZL-1 自身不发荧光,其在生理条件下对生物硫醇半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢响应并释放出红色荧光信号,具有显著的灵敏度和稳定性,仅需极短时间即可准确检测目标分子,且荧光信号持续时间长达 50 min 以上。值得注意的是,该探针表现出良好的线性范围,对各种生物硫醇的检测限低至百纳摩尔级别,可以检测结直肠癌活细胞 WS480 中生物总硫醇和硫化161徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2024,44(3)氢并成像,为在 CRC 诊断中的潜在应用奠定了基础。参考文献:1 中华人民共和国国家卫生健康委员会.中国结直肠癌诊疗规范(2020 年版)J.中华外科杂志,2020,58(8):561-585.2Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA Cancer J Clin,2018,68(6):394-424.3 Bellik L,Gerlini G,Parenti A,et al.Role of conventional treat-ments on circulating and monocyte-derived dendritic cells in color-ectal cancerJ.Clin Immunol,2006,121(1):74-80.4 Zhang SY,Ong CN,Shen HM.Critical roles of intracellular thiols and calcium in parthenolide-induced apoptosis in human colorectal cancer cells J.Cancer Lett,2004,208:143-153.5Chen XQ,Zhou Y,Peng XJ,et al.Fluorescent and colorimetric probes for detection of thiolsJ.Chem Soc Rev,2010,39(6):2120-2135.6 Franco R,Schoneveld OJ,Pappa A,et al.The central role of gluta-thione in the pathophysiology of human diseasesJ.Arch 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