PCR-SSCP原理及应用(1).pdf

PCR-SSCP 原理及应用随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是 PCR 技术问 世以后，各种与 PCR 相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 PCR 产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length PolymorPhism，RFLP)等等已成 为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件 高，不适合一般临床实验室使用.1989 年问世的 PCR-SSCP(下文称 SSCP)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入，而且还被用于 DNA 定量分析，监测 PCR 诊断实验中的交*污 染情况，以及传染源的调查等.由于 SSCP 的突出的优点，近几年被大量地应用.一、SSCP 的原理及特点日本 Orita 等研究发现，单链 DNA 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链 DNA 分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性(Single-Strand ConformationPolymorPhism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又 将 SSCP 用于检查 PCR 扩增产物的基因突变，从而建立了 PCR-SSCP 技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:PCR 扩增靶 DNA;将特异的 PCR 扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链 DNA 分子;将适量的单 链 DNA 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链 DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该 DNA 片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由 于 SSCP 是依据点突变引起单链 DNA 分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链 DNA 分子立体构象的改变不起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该 方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶 DNA片段中未知位置的碱 基突变.Takao，经实验证明小于300bP的DNA片段中的单碱基突变，90%可被 SSCP 发 现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP 方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链 DNA 分离，并且还可以进一步 提纯.用这种方法可以最终从 DNA 序列水平上鉴别突变 DNA 片段.二、SSCP 的不断改进SSCP 技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入 PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着 DNA 银染方法与 PCR-SSCP 结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化.最近，SSCP 值得注意的改进是将 DNA-SSCP 分析，改为 RNA-SSCP 分析，其基本原理是:RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达 90%以上.另外，RNA 不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较 长的引物，内含有启动 RNA 聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.为了进一步提高 SSCP 的检出率，可将 SSCP 分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂 交双链分析(HeterocluPlex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het 法是用 探针与要检测的单链 DNA 或 RNA 进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 补的杂交链在非变性 PAG 凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行 SSCP 和 Het 分析可以使点突变的检出率接近 100%，而且实验简便.三、PCR-SSCP 的实验操作在小于 1Kb 长度的情况下，DNA 片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA 片段长度(核苷酸数)(%)1Kb700b 3.5700b500b 5500b200b 8200b 12在进行 SSCP 前首先要通过 PCR 扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置 1h 使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入 1TbE 封闭，备用.2)电泳取 10lPCR 产物，加入 10l 变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30l 石蜡油，煮沸 5min，取出立刻放入冰浴中 2min 以上，然后将水相全部上样，10-15下 电泳.开始在 300V 电压下电泳 5min，然后在 120V 电泳 8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的 1TbE 缓冲液中染色 30-45min，在紫外灯下观察，或进行银染.3)银染法将 PAG 板用去离子水洗二次，浸入 10%乙醇和 0.5%冰醋酸溶液固定 6min.用去离子水洗二次，再浸入 0.2%AgNO3 溶液中 10min.用去离子水洗 3-5 次，然后浸入 1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色 7min.最后，用 0.75%NaCO3 终止显色.四、SSCP 的应用自从 Orita 等用 SSCP 进行人类 DNA 多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 P53基因的突变、肺癌的 ras 基因突变等.最近 Sugano 等用银染色 SSCP 法，成功地检测 了c-Ki-ras2 基因第 12 位的突变，电泳和银染色过程在 2.5 小时内完成.SSCP 还用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的 CFTR 基因、神经纤维瘤 1 型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar 等用 RNA-SSCP 法检测了 28 名 b 型血友病患者的凝血因子 IX 的基因序列，并与 DNA-SSCP 和直接基因测序法进行了比 较，发现在全长 2.6kbP 的凝血因子 IX 基因组中，有 20 处碱基点突变，RNA-SSCP 可检测 出其中的 70%，而 DNA-SSCP 只能检测出 35%，显示了 RNA-SSCP 比 DNA-SSCP 有更高的灵敏 性.#P#分页标题#e#SSCP 法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测 PCR 实验中的污染 情况、以及病原体传播途径的研究中.YaP 用巢式 PCR 对来自不同国家和地区的 HbV 标品 进行了检测，并对扩增产物进行了 SSCP 分析，发现每个标本的 SSCP 图谱完全不同，不 仅证明了 HbVDNA 具有地区性变异，而且排除了交*性污染的可能性，为保证 PCR 诊断 结果的可靠性找到了好方法.另外，YaP 等还将 SSCP 用于 DNA 定量分析上，他们将 SSCP 与竞争性 PCR 法相结合进行乳腺癌细胞突变 P53 基因的定量分析，并取得了初步成功.该方法的优点在于，内标和待测 DNA 只有一个碱基不同，这样使内标和待测 DNA 有相同 的扩增条件，从而更准确地测出 DNA 的量.从以上可以看出，SSCP 正在分子生物学领域 发挥着巨大的作用.五、SSCP 注意的事项SSCP 是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使 SSCP 达到最佳效果，应 注意下列事项.重复性.影响 SSCP 重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性.一般 SSCP 图谱是二条单链 DNA 带，但有时有的 DNA 片段 可能只呈现一条 SSDNA 带，或者三条以上，这主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的 立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的 结果.靶 DNA 序列长度的影响在实验中发现 SSCP 对短链 DNA 或 RNA 的点突变检出率要比长链 的高，这可能是由于长链 DNA 和 RNA 分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用 较小的缘故.而有人认为在 DNA 链较短的(400bP 以下)情况下，DNA 的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现 354bP 的 DNA 中点突变的检出率仍可达到90%以 上.电泳电压和温度的影响:为了使单链 DNA 保持一定的稳定立体构象，SSCP 应在较低温 度下进行(一般 4-15之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度 升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行 SSCP 时，开始的 5min 应用较 高的电压(250V)，以后用 100V 左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使 不同立体构象的单链 DNA 初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.DNA 片段中点突变的位置对 SSCP 的影响点突变在 DNA 和 RNA 中的位置对 SSCP 检测率的 影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在 DNA链 上的位置(有人认为点突变在 DNA 链中部要比在近端部容易被 SSCP 检测出来).White曾 设计了一组样品 DNA 片段，并将其中的点突变设在 DNA 链的中部，而且该点又正处在发 夹结构顶端的环上，结果发现 SSCP 只能检测出 9 个样品中的 2 个(检出率为 22%)，说明 DNA 链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.SSCP 的结果断定:由于在 SSCP 分析中非变性 PAG 电泳不是根据单链 DNA 分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因 此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在 16-18cm 以上，以检测限为指标来判 定结果.检测限是指突变 DNA 片段与正常 DNA 片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检 测限则判定链的迁移率有改变，说明该 DNA 序列有变化，小于检测限则说明链之间无 变化.例如，一般检测限定为 3mm，那么当两带间距离在 3mm 以上，则说明两链之间有 改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR 产物的上样量，PAG 的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具 体实验进行选择确定.总之，SSCP 分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着 SSCP 分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具.