IHC检测实验方法(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 IHCIHC 检测实验检测实验方法方法 1.1.实验原理实验原理 免疫组织化学（Immunohistochemistry）是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。免疫组织化学染色方法分类：1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3、按结合方式可分为抗原抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等。解螺旋 http:/ 免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。2.2.实验目的实验目的 1.测定体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等；2.测定激素，包括小分子量的甾体激素等；3.测定抗生素和药物；解螺旋 http:/ 等；5.利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等；3.3.实验实验材料材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂（试剂来源仅供参考）（试剂来源仅供参考）1)0.01M PBS Na2HPO4 12H2O 3.08 g,NaH2PO4 2H2O 0.28 g,NaCl 8.5 g 溶于 800 ml 双蒸水中，用 5N NaOH 调 pH 至 7.2，加双蒸水定容至终体积 1000 ml。2)0.01M TBS Tris 60.5 g,NaCl 90.0 g 双蒸水 800 ml 溶解，加 22.5 ml 浓盐酸，调 pH7.6，定容至 1000 ml，配成原液。使用时稀释 10 倍即 0.01M TBS。3)10%TritonX-100 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 4 mlTritonX-100 溶解在 36 ml 0.01M PBS 中，震荡混匀。4)0.3%TritonX-100 10%TritonX-100 15 ml,0.01 M PBS 485 ml 5)0.1M PBS Na2HPO4 30.8g、NaH2PO4 2.8g 和 NaCl 8.5g 溶于 800 ml 双蒸水中，用 5N NaOH 调 pH 至7.2，加双蒸水定容至终体积 1000 ml，高压消毒。6)4%多聚甲醛 多聚甲醛 40g 加入 800 ml 0.1M PBS 中，加入少量的 NaOH，加热至溶解，用 0.1M PBS 定容至 1000 ml，滤纸过滤。7)20%蔗糖 蔗糖 20g 溶于 80 ml 含 4%多聚甲醛的 0.1M PBS 中，用 0.1M PBS 定容至 100 ml，高压消毒（0.15kPa，20min）。8)30%蔗糖 解螺旋 http:/ 30g 溶于 80 ml 0.1M PBS 中，用 0.1M PBS 定容至 100 ml，高压消毒（0.15kPa，20min）。9)保护液 蔗糖 300g 溶于 500 ml 0.1M PBS 中，高压灭菌（0.15kPa，20min）后加入 300 ml 乙二醇，用灭菌双蒸水定容至 1000 ml。10)0.3%H2O2（0.01M PBS）0.01M PBS 29.7 ml,30%H2O2 0.3 ml 11)封闭液：0.01M PBS 9.2 ml,BSA(牛血清白蛋白)0.1 g,10%Triton X-100 0.4 ml 血清 0.4 ml 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 4 12）一抗稀释液（1%羊血清）0.3%Triton X-100 990 ul，羊血清 10 ul 13）二抗稀释液 （0.3%Triton X-100）995 ul，羊抗兔 IgG 5 ul 3.2.3.2.主要仪器主要仪器 仪器名称仪器名称 来源来源 型号型号 振动切片机 徕卡 VT1200s 生物组织自动包埋机 阔海医疗 KH-BQ 3.3.3.3.其他其他 本步骤为具体细节根据自己实验室的情况进行灵活调整。4.4.实验步骤实验步骤 免疫荧光实验步骤：解螺旋 http:/ TBS 洗干净 OCT。TBS 中 4 度短期保存。3.0.5%Triton X-100 孵育 1h。(0.5%Triton X-100=1ml Triton X-100 in 200ml TBS)4.血清封闭 2h(RT,pH7.4)5.一抗 4 度过夜,或者两晚。6.室温下复温 30mins 7.TBS 冲洗 10minsX4（建议把时间和次数保证好，这样染得片子背景底，着色清楚）。8.二抗 2h RT 9.DAPI(1:2000)5mins 10.TBS 冲洗 10minsX4 11.封片 解螺旋 http:/ 陪伴医生科研成长 http:/ 5 5.5.典型文献典型文献 1.Tang Y,Reissig S,Glasmacher E,et al.Alternative Splice Forms of CYLD Mediate Ubiquitination of SMAD7 to Prevent TGFB Signaling and Promote Colitis.Gastroenterology 2018.解螺旋 http:/