HRM实验指导.pdf

高分辨熔解曲线分析技术高分辨熔解曲线分析技术 高分辨熔解曲线分析技术，high resolution melting，简称 HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的 PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在 PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。HRM 的主要原理是根据 DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入 DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与 PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。实验前准备实验前准备 在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler 480 Control Kit和High Resolution Melting Master等。High Resolution Melting Master中含有2 Master Mix(包含热启动Taq DNA Polymerase反应缓冲液，dNTP mix，高分辨率染料),25mM MgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP盒装吸头、冰盒，罗氏的 LightCycler 480，还有常规的离心机、水浴锅等。HRM 体系配制体系配制 实验中用到的 HRM 试剂盒需要对 MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA 样品为例展开实验。先加入 1 号管的 2 Master Mix 165l，再加入 9 号管的 primer mix 33l，最后加 8 号管的 mutation 突变体 33l，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。分装好做 mutation 样品的 Mg2+浓度，以第1第2管来演示配制3.3倍体积加样。在1管中加入4l MgCl2，再加入16l 水。同样地，在2管中加入5.3l MgCl2和14.5l 水，其他管按照对应的体积配制即可。同时根据说明书配制好 WT 野 生型和 Het 杂合子的样品。注意在配制过程中要吹打混匀。配制好反应体系后，各吸取20l 于96孔板中，设置3个重复。上样完毕，盖上盖板膜，确保其密封性。将96孔板放入 LightCycler 480进行 HRM 的 QPCR实验。程序设置程序设置 打开软件，在 New Experiment 界面下进行反应条件设定。样品体积为20l，预变性95 C 5min，无需采集荧光。在扩增反应中，设置45个 Cycles，变性95 C 10s，退火65 C 10s，延伸72 C 20s 并收集荧光。设置溶解曲线，各参数如屏幕所示。设置完毕后，即可点击保存，并开始 PCR 反应。样品编辑样品编辑 点击 Sample Editor 进入样品编辑，选择 Scanning 模式。选中相同的样品孔，设置名称和类型，点击 Make Replicates 设为复孔。按照此方法根据实际情况编辑好样品，并将本次实验的所有样品孔收编为一个子集，方便后续操作。结果分析 结果分析 选择 Gene Scanning，Subset 选择需要分析的子集，按确认，进入 HRM 数据分析界面。在 Negatives 界面中曲线表示出了阴性样品的所在，通常不需要在这界面操作。在 Normalization 界面中，进行均一化处理熔解前和熔解后的曲线。根据实验的具体情况设定 Pre-melt Slider 和 Post-melt Slider 的温度范围，控制在1 C 的范围内。在下方窗口可见经过处理后的曲线，在 Temperature Shift 界面中，横向均一化曲线。设定 Threshold 的值在 0-5%的范围内，即可达到理想效果。在Difference Plot 界面下点击 Calculate，即可得到 HRM 分型的结果。软件会根据标准品的曲线形状，将待测样品的分型结果自动归到相应的基因型中，用不同颜色标记。通过分型图，可以得出：3.0mM 的 MgCl2是该实验的最佳 Mg2+浓度，并且可得到很好的分析效果。疑问解答疑问解答 实验做完了，现在进入疑难解答时间 Doctor A,我们能用 SYBR Green 染料来进行 HRM 实验吗？Miss Q，答案明显是不能的。采用饱和的荧光染料是进行 HRM 分析的必备条件之一。本次 mix 中所含有的高分辨染料在 PCR 时以饱和的浓度加入，不会抑制 PCR 反应。在进行 HRM 分析时，由于饱和染料占据了 DNA 双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化。饱和染料在 DNA 解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。而传统的荧光染料 Sybr Green 是非饱和染料，浓度过高会抑制 PCR 反应且容易出现假阴性，特异性下降等情况。非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。使用非饱和性染料只能区分片段大小和 GC 含量差异较显著的序列。所以 SYBR Green 不适合用来做高分辨率的HRM 实验。DoctorA，染料法所固有的缺陷，那么我们该怎样优化 HRM 的实验质量呢？Miss Q，这问题很好。染料法无法区分非特异性产物和引物二聚体的问题，我们可以通过引物，模板，Mg2+浓度等方面来优化 HRM 实验。对于引物设计，要保证退火温度在 60左右，扩增片段长度小于 250bp，最好是在 100-150bp 这个范围内。建议使用专门的引物设计软件并使用高纯度的引物。模板的上样浓度在 5-30ng/20ul 为佳，这样可以保证扩增曲线的 Cq 值在 30个循环前。确保所有样品的核酸提取方法是一样的，建议在上样前用吸光度测一下样品核酸浓度，调整模板浓度使它们的起始浓度相同。Mg2+对浓度 PCR 的优化起着至关重要的作用，从上述的实验结果中我们可以看到，当 Mg2+浓度过低时，PCR 起跳会很晚。Mg2+浓度很高时，这个产物的扩增曲线的平台期较低。综合看来，3.0mM 是这个实验最佳的 Mg2+浓度。