EMSA实验指导(2).pdf

凝胶迁移实验凝胶迁移实验(EMSA)凝胶迁移实验是一种研究 DNA 与蛋白质或 RNA 与蛋白质相互作用的常用技术，这项技术是基于 DNA 蛋白质或 RNA 蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理。本实验是将提取到的蛋白粗提液，与生物素标记的DNA 一同保温，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA 复合物比非结合的探针移动得慢。EMSA 中结合滞后条带的有无，以及量的多少可反映出 DNA 结合蛋白与 DNA 探针的结合活性，DNA 结合蛋白的表达及活化水平。近年来，EMSA 已发展成为体外研究核酸，尤其是 DNA 与蛋白质相互作用的一种简单，迅速，而灵敏的方法，已成为了转录因子与核酸体外相互作用的经典方法。实验前准备实验前准备 在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，所需的试剂盒包括：核蛋白提取试剂盒，EMSA 检测试剂盒等，需从冰箱里拿出室温解冻或冰上解冻待用。本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司提供的的 Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、QSP 盒装吸头及 Nunc 冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器，离心机，恒温水浴锅摇床等。下面进入实验部分，首先介绍本实验基本操作流程为，先进行核蛋白的提取以及定量，探针标记，随后进行凝胶的配置及预电泳，根据得到的核蛋白与探针，进行样品的制备，上样进行电泳，经过电泳分离后，转移到尼龙膜上，最后进行显色。核蛋白提取核蛋白提取 本步骤是参照 NE-PER Nuclear and cytoplasmic Extraction Reagents 展开的实验。首先将现用现配的 Buffer A 和 Buffer C 配置好，Buffer A 是 1ml CER I 加入10l 蛋白酶抑制剂，Buffer C 是 1ml ER Buffer 加入 10l 蛋白酶抑制剂.配置好，混匀后放置于冰盒中。取数量约为 5 106-107/ml 的待用细胞，用预冷 PBS 洗涤两遍，尽可能除去上清，勿留残液，估计离心后的压积细胞体积，每 10l 体积，加入 100l 的Buffer A，混匀后涡旋剧烈振荡，冰上放置 10-15min。加入 11l 冷 CER II Buffer，混匀后剧烈振荡 5s，放置冰上 1min，再次振荡5s 后，4，16000 g 离心 5min，尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白。在离心沉淀物中加入 100l 预冷的 Buffer C，最大转速涡旋剧烈振荡 15s，放置冰上 40min，每间隔 10min 涡旋剧烈振荡 15s；4，16000 g 离心 10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白。上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量，分装并保存于-80，避免反复冻融。蛋白浓度测定蛋白浓度测定 选用的是 BCA 法进行测定，首先进行标准样品的准备，设定的标准样品梯度分别为 250、125、50、25、5、0 g/ml BSA，进行梯度稀释标准样品，取 100l样品稀释液各个离心管中，按 1：2 比例稀释标准样品，取 100l 蛋白标准样品到第一个管子中，混匀，吸取第一只管内的 100l 至第 2 个离心管内，混匀，按照图中的操作，进行逐级稀释标样。配置 BCA 工作液，以 50:1 的比例进行 A 液与 B 液的稀释，混匀。取 40l各个梯度标准品至新的离心管后，稀释待测样品。往各个稀释检测样品中加入200l 已配置好的 BCA 工作液。混匀，取 70l 混合液放入 96 孔板中，重复 3 孔，37 C 避光反应 30min。用 Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪进行检测，波长为 562nm，点击 Graph，可见标准曲线，回归方程，方差。可计算得到待测样品的浓度。探针的制备探针的制备 取部分已制备好的 100M 的储液合成探针稀释到 20M，取 10l 稀释液，加入等体积的互补探针，混匀，混合的探针在 95 5min 变性后 70维持 20min，然后马上拿到室温环境使其缓慢冷却至室温，在这一过程中互补单链退火成双链探针。探针使用的终浓度一般为 1nM。凝胶电泳凝胶电泳 制胶及预电泳，本实验按照表格中的配方，进行 6.5%凝胶的配制，EMSA实验无需另外配制分离胶和浓缩胶，注意在加入 AP 前，需要室温静置 10min 脱气，然后再加入 10%AP 混匀灌胶即可。在加样电泳前，先进行预电泳，电泳缓冲液为预冷的 0.5 TBE 缓冲液，100V恒预电泳 30-60min，此过程需低温环境中进行。注意：预电泳前用移液器反复冲洗上样孔 3-5 次。预电泳时，可进行制样，按照表中的 mix 配方进行体系配置。由于样品数较多，需要配置 mix 混合液，减少加样误差并节约操作时间。配置好反应体系后，分装到各个做好标记的 PCR 管中，按照表格中的体积数，依次加入双蒸水，核蛋白，最后加生物素标记的探针，随后室温孵育 10min。其中核蛋白的量是根据实际情况作相应的调整，一般为 2-10g。孵育结束后，加入 5l Loading Buffer，用枪轻轻吹打混匀，准备上样。在电泳结束之前，需要将 0.5 TBE 电转移缓冲液配置好，并且放置于冰箱预冷待用。将制好的样品全部加载到样品孔中，100V恒压，低温条件下电泳45min左右，指示剂指示到胶的 2/3 处即可。转膜转膜 电泳结束，慢慢从电泳装置的凝胶上移走一片玻璃片，去掉样品孔的凝胶，将凝胶与另一片玻璃一起移入装有 0.5 TBE 的盒中，让凝胶与玻璃板分离并漂浮在缓冲液中。将尼龙膜、同胶一样大小的厚滤纸及海绵垫在 0.5 TBE 中浸泡10min。在转印夹黑色面板中心依次放置海绵垫垫，至少 3 层印迹滤纸，转印膜，胶和至少 3 层滤纸，用玻璃试管在滤纸上轻轻滚动，以驱赶气泡。注意胶与膜之间不可有气泡。将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在 0.5 TBE 中，100V 恒压转 45min左右。转膜好之后，将膜放置于干净滤纸上，膜正面朝上，放置在紫外灯下 10厘米处，交联 20min，交联前保持膜湿润。化学发光检测化学发光检测 将结合膜浸于适量 Blocking Buffer 中，室温轻摇孵育 15min，弃封闭液，将结合膜与新配制的 20ml Streptavidin HRP 反应液在室温孵育 15min，弃反应液，用 1x 洗涤液室温洗膜 4 次，每次 5min，结合膜经四次洗涤后与 30ml 左右的平衡液在室温平衡 5min。在暗室中，以 1:1 比例将底物液 A 和 B 混合，将结合膜从平衡液中移出，放于保鲜膜上，结合面在上。将发光液均匀覆盖于膜的表面。约 1-4min 后，吸走多余发光液，保鲜膜盖在膜表面，其上再盖感光胶片，胶片的曝光时间无法准确决定，每次实验只能多作几张不同曝光度的胶片以获得较佳的图像。实验结果分析：从结果中可以看出，阴性对照反应中，仅在胶片底部出现未结合的自由探针，而实验样品均有 DNA/蛋白质结合带 如果在实验样品制备过程中，设置了探针或突变探针冷竞争反应，即添加了未标记的探针或突变探针，也可进行加入目的蛋白特异抗体的 Super Shift 反应，电泳情况及显影结果可见图中显示。疑问解答疑问解答 Docter A，在实验的最后进行显影时，发现条带信号弱或没有信号，您有什么建议或者解决方法吗?信号弱或没有信号,原因很多。首先有可能是蛋白上样浓度不够。建议增加蛋白质用量，对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在 20-2000ng 间，用粗制核抽提液，需要 1-20g 蛋白形成特异的复合物。或者是核蛋白被降解，所以在核蛋白的提取过程中，提取液中加适量的蛋白酶抑制剂，使用相关商业化的核蛋白提取试剂盒，基本不会出现这个问题。也可能蛋白质转印效率差。建议摸索好转膜时间及转膜条件。曝光或成像时间太短也会造成信号弱。建议增加曝光时间，一般，底物化学发光系统覆盖于膜表面后应立即获取不同时间的图像，以免时间太长后化学发光信号减弱，影响成像，应合理安排好成像时间，必要时可以压片过夜。Docter A，前一个问题是信号弱的情况，有时候也出现信号太强，曝光时间甚至少于 2s，又如何解决呢？出现这种情况，一种可能是感光胶片太敏感。建议将膜放一段时间后重新曝光，或者同一张膜同时叠放几张胶片。其次是底物液灵敏度太高。建议将发光底物液做 15 倍稀释后再使用。探针或核抽提物用量过多也会引起信号过强的情况。此时需要做反应体系的优化，建议减少探针或核抽提物用量。所加入反应的探针的量也需经过预实验的优化，探针应保存在-20以防止降解，在合成或标记后一到两个星期内必需使用，无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。Docter A，在 DNA 探针的选择上，要考虑哪些重要因素？需要考虑的因素有几个方面，首先目的 DNA 的长度应小于 300bp，以有利于非结合探针和蛋白 DNA 复合物的电泳分离。双链合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如果目的蛋白已被鉴定，则应该用短的寡核苷酸片段，约为 25bp,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子或增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用 DNA 酶印迹对蛋白结合的特异区域在 DNA 序列水平上作出分析。在反应体系中加入 Poly dI dC，所起到的作用又是什么呢?Poly dI dC 是由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入 Poly dI dC，可抑制粗制核抽提液中其它 DNA 的结合蛋白结合，如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入 Poly dI dC，若加入，则普通反应中所用终浓度不超过 50-100ng。对核抽提液，每 2-3g 核抽提液用 1g Poly dI dC.谢谢 Doctor A，为我们解答这么多问题。