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6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 文章编号：06-（2004）063002101-10 中图分类号：Q344 中国生命科学论坛分子生物学版精华 RNA 干扰(RNAi)实验技术相关探讨 RNA 干扰(RNAi)实验技术相关探讨 马志杰(maziwise)编写 小瘪 修改 (中国生命科学论坛分子生物学版 第 1 版主)责任编辑：TILS007 摘要：摘要：RNA 干扰(RNAi)是一种由双链 RNA 所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi 技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。关键词：关键词：RNAi；siRNA；转染 小 RNA 作用与应用研究继 2001，2002 连续两年被美国 Science 杂志评为年度 10 大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术 RNA 干扰（RNAi），即用 20 多个核苷酸组成的短的双链 RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi 沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小 RNA 的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小 RNA 对细胞行为的调控、如何利用 RNAi 进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。1、RNAi 的作用机制的作用机制 6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 通过生化和遗传学研究表明，RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子 RNA 被切割为 21-23 核苷酸长的小分子干扰 RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)。证据表明;一个称为 Dicer 的酶，是 RNase III 家族中特 图 1、RNAi 的作用机制 异识别双链 RNA 的一员，它能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链 RNA，切割将 RNA 降解为 19-21bp 的双链 RNAs(siRNAs)，每个片段的 3端都有 2 个碱基突出。在 RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将小分子 RNA 解双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA 转录本上，并在距离 siRNA3端 12 个碱基的位置切割 mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。另外，还有研究证明含有启动子区的 dsRNA 在植物体内同样被切割成 21-23nt 长的片段，这种 dsRNA 可使内源相应的 DNA 序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图 1）：2、RNAi 基本试验程序及注意事项基本试验程序及注意事项 2.1、siRNA 的设计的设计 2.1.1、目标序列的筛选、目标序列的筛选 6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 在设计 RNAi 实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：http:/ http:/ http:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html http:/ 2.1.2、RNAi 目标序列的选取原则目标序列的选取原则 RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的 AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其 3端的 19 个碱基序列，作为潜在的 siRNA靶位点。有研究结果显示 GC 含量在 45%55%左右的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更为有效。Tuschl 等建议在设计 siRNA 时不要针对 5和 3端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP 核酸内切酶复合物结合 mRNA 从而影响 siRNA 的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。例如使用 BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的 siRNA，以找到最有效的 siRNA序列。2.1.3、阴性对照、阴性对照 一个完整的 siRNA 实验应该有阴性对照，作为阴性对照的 siRNA 应该和选中的 siRNA序列有相同的组成，但是和 mRNA 没有明显的同源性。通常的做法是将选中的 siRNA 序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。2.1.4、目前已证实的、目前已证实的 siRNA 可以在下面的网页找到：可以在下面的网页找到：人源：http:/ 鼠源：http:/ 其他：http:/ 2.2、siRNA 的制备的制备 目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断 dsRNAs 经 RNase III 类降解(e.g.Dicer，E.coli，RNase III)体外制备 siRNA，以及通过 siRNA 表达载体或者病毒载体，PCR 制备的 siRNA 表达框在细胞中表达产生 siRNA。2.2.1、体外制备、体外制备 2.2.1.1、化学合成、化学合成 6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 当前，许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成 siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成 34 对 siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的 siRNA 的情况下，需要大量 siRNA 进行研究 不适用于：筛选 siRNA 等长时间的研究，主要原因是价格因素 2.2.1.2、体外转录、体外转录 以 DNA Oligo 为模版，通过体外转录合成 siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到 siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的 siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs 毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的 siRNA 量的 1/10 就可以达到化学合成 siRNA 所能达到的效果，从而使转染效率更高。最适用于：筛选 siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的 siRNA。长期研究。2.2.1.3、用、用 RNase III 消化长片断双链消化长片断双链 RNA 制备制备 siRNA 其他制备 siRNA 的方法的缺陷是需要设计和检验多个 siRNA 序列以便找到一个有效的 siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种 siRNAs“混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。选择通常是 2001000 碱基的靶 mRNA 模版，用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA，然后用 RNase III(or Dicer)在体外消化，得到一种 siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的 dsRNA 后，这个 siRNA 混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA 转染一样。由于 siRNA 混合物中有许多不同的 siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsRNA 消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效 siRNA 序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用 RNAse III 通常比用 Dicer 要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的 siRNA 进行研究，特别是基因治疗 2.2.2、体内表达、体内表达 前面的 3 种方法主要都是体外制备 siRNAs，并且需要专门的 RNA 转染试剂将 siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 模版中在体内转录得到 siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作 RNA。2.2.2.1、siRNA 表达载体表达载体 多数的 siRNA 表达载体依赖三种 RNA 聚合酶 III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹 RNA(short hairpin RNA，shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的 U6 启动子和人 H1 启动子。之所以采用 RNA pol III 启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 RNA，而且它是通过添加一串（3 到 6 个）U 来终止转录的。要使用这类载体，需要订购 2 段编码短发夹 RNA 序列的 DNA 单链，退火，克隆到相应载体的 pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA 表达载体的优点在于可以进行较长期研究带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于 siRNA 表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。最适用于：已知一个有效的 siRNA 序列，需要维持较长时间的基因沉默。不适用于：筛选 siRNA 序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。2.2.2.2、siRNA 表达框架表达框架 siRNA 表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由 PCR 得到的 siRNA 表达模版，包括一个 RNA pol III 启动子，一段发夹结构 siRNA，一个 RNA pol III 终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和 siRNA 表达载体不同的是，SECs 不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由 PCR 得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选 siRNA 的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和 siRNA 的最适搭配。如果在 PCR 两端添加酶切位点，那么通过 SECs 筛选出的最有效的 siRNA 后，可以直接克隆到载体中构建 siRNA 表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达 siRNA 和长效抑制的研究。这个方法的主要缺点是PCR 产物很难转染到细胞中（晶赛公司的 Protocal 可以解决这一问题）不能进行序列测定，PCR 和 DNA 合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。最适用于：筛选 siRNA 序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）2.3、siRNA 的转染的转染 将制备好的 siRNA，siRNA 表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：2.3.1、磷酸钙共沉淀、磷酸钙共沉淀 6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 将氯化钙，RNA(或 DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含 DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个 pH 都会导致磷酸钙转染的失败。2.3.2、电穿孔法、电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。2.3.3、DEAE-葡聚糖和葡聚糖和 polybrene 带正电的 DEAE-葡聚糖或 polybrene 多聚体复合物和带负电的 DNA 分子使得 DNA 可以结合在细胞表面。通过使用 DMSO 或甘油获得的渗透休克将 DNA 复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。2.3.4、机械法、机械法 转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将 DNA，RNA 或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile 将大分子导入细胞。2.3.5、阳离子脂质体试剂、阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到 DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的 DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成 DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约 5kb 的质粒会结合 2-4 个脂质体。被俘获的 DNA 就会被导入培养的细胞。现存对 DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。2.4、siRNA 的高转染效率需注意的几点事项的高转染效率需注意的几点事项 为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：1.纯化 siRNA 在转染前要确认 siRNA 的大小和纯度。为得到高纯度的 siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过 15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的 RNA 通常需要跑胶电泳纯化（即 PAGE 胶纯化）。2.避免 RNA 酶污染 微量的RNA 酶将导致 siRNA 实验失败。由于实验环境中 RNA 酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受 RNA 酶污染非常重要。3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常，健康的细胞转染效率较高。6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用 50 代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。4.避免使用抗生素 Ambion 公司推荐从细胞种植到转染后 72 小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在 siRNA 转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。5.选择合适的转染试剂 针对 siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对 siRNA 实验的成功至关重要。6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的 siRNA 转入靶细胞（同样适合实验靶 siRNA），转染 48 小时后统计对照蛋白或 mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。过多的 siRNA 将导致细胞毒性以至死亡。7.通过标记 siRNA 来优化实验 荧光标记的 siRNA 能用来分析 siRNA 稳定性和转染效率。标记的 siRNA 还可用作 siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了 siRNA 的细胞。3、制备制备 siRNAs 或者或者 dsRNA 试剂盒的选取试剂盒的选取 长片断的 dsRNA 可以在植物、原生动物、昆虫、线虫中引发基因沉默。要研究这些对象，自己制备长片断的 dsRNA 是很容易做到的：通过合适的质粒亚克隆线性化体外转录的方法，就可以自己合成 dsRNA。目前已经有商品化合成 dsRNA 的试剂盒（例如NEB 的 HiScribe RNAi Transcription Kit，后文介绍）。但是在哺乳动物细胞中，超过 30nt 的dsRNAs 则引起非特异基因沉默。实验表明，在哺乳动物细胞内引发特异的基因沉默最有效的 siRNAs 是有 19 个碱基互补，两边 3端各有 2 个碱基突出（通常是 UU，但是目前不清楚UU 对 siRNAs 的活性影响有多大）的一对 21-mer 的 dsRNAs。由于体外转录利用 T7RNA聚合酶进行体外扩增的时候，通常要求序列的首 2 个碱基为 GG 或者 GA 以提高合成效率，但是这两个额外的碱基会大大降低 siRNAs 的活性，而且通常体外转录很难高效合成这么小的 RNA（通常需在 25nt 以上），因而早先哺乳动物细胞的 RNAi 实验中用到的 siRNAs 是用化学方法合成的，方便，简洁，不受碱基的限制。可是不管怎么说，化学合成 RNA 的费用是相当高的（一个碱基要将近 400 元），特别是在哺乳动物细胞中 siRNAs 的效率不一，一般一个基因需要设计 35 对 siRNAs 以确定最有效的，这样的费用就高了（就是 610 条 siRNAs（每条 21nt），一个基因通常花费不少于20000）。如果需要重复设计，在国内还有时间上的困扰。现在，多个厂家推出了不同的试剂盒，一个试剂盒可以自行设计合成多个 siRNAs，灵活性和可控性都明显提高，不失为一种经济的选择。例如在体外转录制备 siRNA 时，Silencer™siRNA Construction KitLower Cost&Higher Potency siRNAs Ambion 公司的这个试剂盒是建立在体外转录的基础上的，其专利的设计有效克服了前面提到的难题，6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 原理非常简单：首先合成两段 29-mer 的 DNA 作为模版（DNA 合成的价格就便宜多了，即使是全球最著名的 DNA 合成供应商 Operon，也就是 7、8 块钱一个碱基），包括 8 个与 T7启动子引物 3端匹配的碱基（称为引导序列，leader sequence）和 21 个设计的 siRNA 序列。将这两个模版和对应的 T7 启动子引物分别混合，引物末端和 DNA 模版褪火结合，用 DNA聚合酶 Klenow 大片断补平成为双链 DNA 模版，分别用 T7 RNA 聚合酶进行体外转录，将产物混合形成 dsRNA，新的双链 RNA 包含 5端单链的引导序列和中间互补的 19 个碱基序列以及 3端两个重复的 U（UU）。通过 DNA 酶降解模版，同时用单链专一的核酸酶消化 5的引导序列，由于 RNase 不能切开 U 碱基也不能切双链 RNA，所以得到的产物就是我们需要的 21-mer 的双链 siRNAs有 19 个碱基互补，3端各有 2 个 U 突出。通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到的就是可以立即转化用的 siRNAs！4、RNAi 存在的若干问题及其前景展望的若干问题及其前景展望 目前 RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。siRNA 在哺乳动物细胞中抑制 mRNA 表达是有效的，但并不能象果蝇细胞那样完全抑制目的基因的表达，可能是因为生物体是一个复杂的系统，存在多种机制相互作用以调控基因的表达。另外，在哺乳动物中，RNAi 能否成功地抑制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型。对线虫来说，可以采用注射、浸泡或喂食的方法转入 dsRNA，而对哺乳动物来说，寻找高效的方式来转入 siRNA 以及快速的方式来筛选 RNAi 尚需进一步探索。RNAi 在抗病毒感染中的应用令人振奋，但能否成功还无法保证。在研究中亦有诸多困难：（1）并不是所有的病毒 RNA序列都能比较容易的接近 siRNA，被识别、切割。有些病毒靶序列可能隐藏在二级结构下，或者位于高度折叠的区域中，而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合物，阻碍了与siRNA 的识别。（2）病毒的复制过程并不严格，随意性很强，因此往往产生突变的子代。这一特点能够帮助病毒躲避机体的免疫监控和药物的抑制作用，同时也会干扰 siRNA 的识别。（3）在 siRNA 的导入问题上，同样也面临着技术上的困难。（4）因为细胞内的 RNA 酶会降解 siRNA，故怎样保证 siRNA 的稳定性仍是一个亟需解决的问题。尽管目前对 RNAi 的研究还不够深入，RNAi 还不够完善，但这种现象在自然界是普遍存在且有效的，其应用前景十分广阔。它不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展，还有可能设计出 RNAi 芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用 RNAi 技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。从发现 RNAi 现象至今，只有短短的几年时间，但由于它的重要作用，使其成为生命科学中的研究热点。今后的研究应主要集中于RNAi作用的机制及如何进一步完善RNAi技术。6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 可以相信，RNAi 技术必将为生命科学研究和临床治疗带来新的革命。5、有价值参考资料有价值参考资料 5.1、RNAi：基因沉默向导（影印）现代生物技术前沿 2004 年 2 月出版，ISBN 7-03-012685-8/Q.1363，大 16 开，平装，436 页，定价:65.00元，RNAi:A Guide to Gene Silencing，Gregory J.Hannon，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press,2004 RNA 组学研究日益蓬勃发展。RNA 的相关研究被美国科学杂志评为 2002 年的十大进展。人们发现，双链 RNA 可以抑制含有特定序列的基因表达。应用 RNA 的这一特点，在生物体外强有力地使基因沉默即 RNA 干扰，从而开创了一个新的和正在快速发展的生命科研领域。RNA 干扰技术可以加速人们对人类基因功能的认识，而且科研人员有望利用这种技术设计出使致病基因失活的新型基因药物。本书由这一领域内的著名专家撰写，内容新颖全面，系统性强，具有很高的参考价值。主要内容包括 RNA 干扰的基本概念、生物化学研究，双链 RNA 对基因组的调节，哺乳动物基因表达中的 shRNA 介导沉默，核酶超家族，以及 RNA 干扰在多种动物模型中使基因沉默的方案。本书适合发育生物学、细胞生物学、遗传学、基因组学、神经生物学和分子生物学等生命科学相关领域的教学研究人员以及本科生、研究生参考。5.2、RNA 干涉/曹国军、邵宁生/军事医学科学院基础医学研究所 http:/ 新生命网站编译 5.3、RNAi 的回顾（生物通网）http:/ 5.4、RNAi：制备 siRNAs 的 5 种方法如何选择最适合你的方法 http:/ 里面还有一些相关的链接。5.5、shRNA 文库：RNA 干扰研究者的福音 http:/ 5.6、RNAi 参考文献共享 http:/ 6-RNA 干扰实验技术相关探讨改干扰实验技术相关探讨改.doc TILS中国生命科学论坛中国生命科学论坛 精华专刊精华专刊 2004 年第年第 1 期期 5.7、我想就 RNA 干扰开辟一个话题，请欢迎大家参加 http:/ 5.8、网络资源 RNAi 全球资源集锦 1 2 3 4 http:/ 5.9、RNA 干扰（RNAi）及其应用 http:/ （责任编辑 TILS007）