RACE技术(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 RACERACE 技术技术 1.实验原理实验原理 近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于 PCR 从低丰度的转录本中快速扩增 cDNA 的 5和 3末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。RACE 采用 PCR 技术由已知的部分 cDNA 顺序来扩增出完整 cDNA5和 3末端，是一种简便而有效的方法,包括单边 PCR 和锚定 PCR。2.实验实验目的目的 1.可用于 cDNA 文库的构建及筛选。解螺旋 http:/ RACE 克隆已知片段的旁侧内部序列。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 3.RACE 可用于克隆同源基因的同源片段，为寻找同源基因提供了一种手段。4.RACE 技术与生物信息学,例如 EST 库相结合,具有快速,高效克隆新基因的特点。3.实验材料实验材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 LB 培养基、Amp 或 Kana 抗生素、50甘油等 3.2.3.2.主要仪器主要仪器 离心机、PCR 仪、酶标仪、电泳仪、凝胶成像系统 4.4.操作操作步骤步骤 4.1.4.1.3RACE3RACE-PCRPCR 1.利用 mRNA 的 3末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有 SMART 寡核营酸序列通用接头引物的 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物反转录合成标准第一链 cDNA。2.用一个基因特异引物 GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以 cDNA 第一链为模板,进行PCR循环，把目的基因3末端的DNA片段扩增出来。解螺旋http:/ 陪伴医生科研成长 http:/ 3 4.2.4.2.5 5RACERACE-PCRPCR 1.先利用 mRNA 的 3末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物在反转录酶 MMLV 作用下，反转录合成标准第一链 cDNA。2.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的 5末端时自动加上3-5 个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有 SMART 寡核苷酸序列 Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转 换 为 以SMART序 列 为 模 板 继 续 延 伸 而 连 上 通 用 接 头。解 螺 旋http:/ UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物 2(GSP 2 gene specific primer,GSP)作为下游引物，以 SMART 第一链cDNA 为模板，进行 PCR 循环，把目的基因 5末端的 cDNA 片段扩增出来。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 4 4.最终，从 2 个有相互重叠序列的 3/5-RACE 产物中获得全长 cDNA，或者通过分析RACE 产物的 3和 5端序列，合成相应引物扩增出全长 cDNA。5.应用实例文献应用实例文献1 1.Yu X,Yuan Z,Yang Z,et al.The novel long noncoding RNA u50535 promotes colorectal cancer growth and metastasis by regulating CCL20.Cell Death Dis 2018;9 9(7):751.解螺旋 http:/