Northern Blot原理及实验方法(1).pdf

Northern Blot 原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的 RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。实验方法：仪器、试剂、材料（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。（二）材料总 RNA 样品或 mRNA 样品，探针模板 DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：NorthernMax Kit（Cat.#1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC,X 光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmola-32PdCTP，Exo-freeKlenow Fragment 和10 X Buffer,Sephadex G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。方法与步骤1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用 DEPC 水冲洗，干燥备用。处理 DEPC 水(2 L)备用。2用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用 DEPC 水冲洗二次，去除 RNAZap。3制胶：1 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC 水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60空气浴平衡溶液(需加 DEPC 水补充蒸发的水分)2 在通风厨中加入3.6ml 的10Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。3 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。4胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer 盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml1MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的 buffer。）5检查点样孔。4.RNA 样品的制备在 RNA 样品中加入3倍体积的 formaldehyde load dye 和适当的 EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。5.电泳：1.将 RNA 样品小心加到点样孔中。2.在5V/cm 下跑胶（514cm）。在电泳过程中，每隔30min 短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。3.紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。6.转膜1用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用 DEPC 水冲洗。2用 RNAZap 擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用 DEPC 水冲洗二次。3连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在 Transfer buffer 浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。4盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。5将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。6将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。7打开真空泵，使压强维持在5058mbar；立即将 transfer buffer 加到胶面和四周。每隔10min 在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。8转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。9用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于 UV 交联仪中自动交联。10将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)12将膜在-20保存。7.探针的制备1在1.5ml 离心管中配制以下反应液：模板 DNA(25 ng)1ulRandom Primer 2ul 灭菌水 11ul 总体积：14ul295C 加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。3在离心管中按下列顺序加入以下溶液：10Buffer 2.5uldNTP Mixture 2.5ul111 TBq/mmola-32PdCTP 5 ulExo-free Klenow Fragment 1 ul4混匀后（25ul），37C 下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。565C 加热5min 使酶失活。8.探针的纯化及比活性测定：1准备凝胶：将1g 凝胶加入30ml 的 DEPC 水中，浸泡过夜。用 DEPC 水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。2取1ml 一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填 Sephadex G-50凝胶。3将注射器放入一支15ml 离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g 离心4分钟，凝胶压紧后，补加 Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml 刻度处4100ul STE 缓冲液洗柱，1600g 离心4min。重复3次。5 倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml 离心管置于管中，再将装填了 Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml 离心管。6将标记的 DNA 样品加入25 ul STE，取出0.5ul 点样于 DE8paper 上，其余上样于层析柱上。71600g 离心4min，DNA 将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入 DNA 的 dNTP 则保留在层析柱中。取0.5ul 己纯化的探针点样于 DE8-paper.8 测比活性。9预杂交：1将预杂交液在杂交炉中68预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。2 加入适当的 ULRAhyb 到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb 杂交液)，42预杂交4 hr。10探针变性：1用10 mM EDTA 将探针稀释10倍。290热处理稀释后探针10min 后，立即放置于冰上5min。3短暂离心，将溶液收集到管底。11杂交：1加入0.5ml ULTRAhyb 到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。242杂交过夜（1424hr）。杂交完后，将杂交液收集起来于20保存。12洗膜：1低严紧性洗膜：加入 Low Stringency Wash Solution#1(100cm2膜面积加入20ml 洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min 两次。2高严紧性洗膜：加入 High Stringency Wash Solution#2(100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42 摇动洗膜20min 两次。13曝光：1 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。2 检查膜上放射性强度，估计曝光时间3 将 X 光底片覆盖与膜上，曝光4 冲洗 X 光底片，扫描记录结果。14去除膜上的探针：将200ml0.1%SDS（由 DEPC 水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让 SDS 冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。15杂交结果操作应该小心，但不必紧张。用于 RNA 电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去 RNAse酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡