Neon 演示准备及操作步骤.pdf

Neon 演示准备及操作步骤 一、一、材料材料准备准备：以以 24 孔板培养为标准孔板培养为标准：1细胞：细胞：数量要求：0.5-5*105 cells/well 10L 体系，贴壁细胞，需要 0.5-2*105 cells/well。10L 体系，悬浮细胞，需要 0.5-5*105 cells/well。Note：保证细胞状态比较好，密度在 70%-90%，在实验当天消化细胞，计数，计算活率。建议使用 Countess 细胞计数仪，30 秒内获得准确的细胞量以及细胞存活率。2质粒：质粒：浓度要求：浓度要求：1-5g/L，10L 体系加入的量不能超过 1L,根据下面具体的数据调整：10L 体系，贴壁细胞，加入的质粒量为 0.5g/well。10L 体系，悬浮细胞，加入的质粒量为 1g/well。Note：DNA 纯度要高，以去离子水或 TE 溶解。建议使用 Invitrogen 的 PureLink Hipure plasmid kit 或者 PureLink Hipure plasmid filter kit 抽提质粒。不建议使用国产试剂盒。加入质粒的体积不能超过转染总体积的加入质粒的体积不能超过转染总体积的 10%。3 siRNA（做（做 RNAi 的客户）的客户）：浓度要求：500M-1mM，根据下面具体的数据调整：10L 体系，贴壁细胞，siRNA 的终浓度为 100nM 10L 体系，悬浮细胞，siRNA 的终浓度为 200nM Note：高质量的 siRNA 双链，溶于无核酸酶的水中。建议使用 Invitrogen 的 stealth siRNA。加入加入 siRNA 的体积不能超过转染总体积的的体积不能超过转染总体积的 10%。4培养基培养基：实验当天，24 孔板孔板中准备好含血清及添加剂含血清及添加剂，不含抗生素不含抗生素的培养基（与您需要转染细胞的一致的培养环境，仅扣除抗生素），500L/孔孔，370C 孵育备用。5.耗材及试剂耗材及试剂：移液枪（至少 20/100/1000L 各一支）一套；灭菌的枪头（10/200/1000L 各一盒）；灭菌的 PBS 缓冲液，不含钙镁离子不含钙镁离子；胰酶、血清及各种培养基添加剂等；75%酒精（棉球或喷壶都可以）；灭菌的离心管（1.5mL 及 15mL 各一盒）；未开封的 24 孔细胞培养板；一次性无菌手套若干；已经过紫外处理超净工作台或安全柜；记号笔；白大褂；插线板（如电源离操作台面距离过远）；低速离心机；二氧化碳培养箱等常规设备。二、二、操作进行操作进行：1.仪器仪器连接：连接：必须保证连接紧密必须保证连接紧密 图 1，移液枪基座与主机连接 图 2，电源线与主机连接 2.Tube 管安装管安装：电极要对正电极要对正（可听到咔嗒一声）（可听到咔嗒一声）3.用移液枪安装一个用移液枪安装一个 Tips，并吸取，并吸取混匀的细胞和质粒混匀的细胞和质粒（采用（采用 R Buffer 重悬）重悬），放置到基座上，放置到基座上：4.调整参数，按“调整参数，按“Start”键”键：触摸屏上显示触摸屏上显示 Complete(完成完成)，说明电穿孔已完成说明电穿孔已完成 5.取下移液枪，将样本转移到培养基中取下移液枪，将样本转移到培养基中：6其他样本操作一样，最后电转结束，将培养板放置于其他样本操作一样，最后电转结束，将培养板放置于 37培养箱中培养。培养箱中培养。仪器放回包装箱。仪器放回包装箱。7.用户根据自己试验安排进行结果观察或检测。如果对试验环节或者结果有疑问，可咨询用户根据自己试验安排进行结果观察或检测。如果对试验环节或者结果有疑问，可咨询 Technical Support。如图 3，将 tube 管放置在基座上面，并加 3mL 的 E Buffer