PCR-SSCP实验操作详细步骤(1).pdf

PCR-SSCP 实验步骤 一样品制备 1 PCR 扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行 PCR 扩增。扩增产物用 2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量 3-5ul。PCR 产物为 10ng/nl 左右为最佳。2PCR 产物与变性 buffer 混合。在干净的 PCR 管底部加入 5ul SSCP 上样缓冲液（变性缓冲液，同分子克隆中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入 PCR 扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加 1ul，效果很好加 0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2 或 3 不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加 3ul 的 PCR 产物，缓冲液加到 8ul 变性效果更好。3PCR 产物变性。加好的样品进行离心，使样品集中在管底。PCR 仪上 95变性 10 分钟，立即取出 PCR 产物连同架子一同置于冰上静置 5min，以免变性的产物复性。注：3 和 4 步可以在制 SSCP 胶第四步后，等胶凝的过程中进行。二制胶 1 装板。在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用 ddH2O 冲洗，然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待 2-3min 酒精挥发。将玻璃板组装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。（可用无水乙醇测试是否漏胶）。2 配胶。甘油浓度 50%的几种浓度大板胶（10ml 下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：8%6%30%PAGE 2.7ml 1ml 10TBE 1ml 0.5ml 50%甘油 1ml 0.5ml ddH2O 5ml 3ml APS 70ul 70ul TEMED 12ul 8ul Total 10ml 5ml 甘油浓度 50%的几种浓度小板胶（15ml 下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）8%6%30%PAGE（4）4.05ml 2 ml 10TBE 1.5ml 1m 50%甘油 1.5m 1m ddH2O 7.5ml 6ml APS 105ul 70 ul TEMED 12ul 12ul Total 15ml 10ml 3灌胶。配好胶后搅匀，灌入装好的玻璃板中，注意不能产生气泡，如果产生气泡把板立起，轻轻敲打可使气泡升出胶面，胶面与凹板上沿大约差 0.5cm 时插上梳子，要保证梳子齿和液面接触处没有气泡，一旦产生要拔出重插。4静置。灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度（10o以下）静置水平桌面上 30min 左右使之充分聚合。注：此时可以进行 PCR 样品变性，即第一部分的 3、4 步。二 上样 1.安板。PAGE 聚合好后要及时拔出梳子（时间耽搁长后会使梳子很难拔出），拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。用夹子把胶板固定在电泳槽上，凹槽的一面朝里，安板时首先使板的底边一端先接触电泳液，再缓慢地过度到另一端，以免产生大气泡（产生大气泡会使电泳条带弯曲）。2预电泳。从底槽把一些电泳液 1TBE 吸到上槽，使液面高出玻璃板矮边 1cm 以上，并确保上槽不漏液。打开电源，大槽电压调到 140-150V，小槽 110-120V，预电泳 10min 左右。(0.1W/cm,10，1-3h)3点样。用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。由于边缘效应带型不整齐，每块板中最边上的两个孔最好不要点样。4电泳。大槽电压 140-150V，小槽 110-120V，温度在 10-15，恒温电泳 10 个小时以上。三 染色 1固定。把胶卸下，做好起始记号，放入 70%乙醇中在摇床上固定 15min。固定好后乙醇回收（可以重复使用 5 次左右），蒸馏水洗两遍，每遍 3min 左右。若同时染两块胶固定和洗脱都要适当增加时间。2染色。染色液（200ml 染色液含 3.6%的 NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水 2ml）染色 30min，同时染两块胶要适当增加时间，需 40min 左右。倒掉染色液，洗 3 遍，每遍 3min，同时染两块胶要适当增加时间。3显色。显色液（200ml 显色液包含 1%柠檬酸钠 1ml，甲醛 100ul）至清晰。倒掉显色液，加蒸馏洗脱 3 次停显。(也可将凝胶浸在含 0.5ug/ml 溴化锭的 1TBE 缓冲液中染色 10min，在紫外灯下观察)附录 1.甘油浓度 50%的几种浓度大板胶（10ml 下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：8%6%30%PAGE 2.7ml 1ml 10TBE 1ml 0.5ml 50%甘油 1ml 0.5ml ddH2O 5ml 3ml APS 70ul 70ul TEMED 12ul 8ul Total 10ml 5ml 2.甘油浓度 50%的几种浓度小板胶（15ml 下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）8%6%30%PAGE 4.05ml 2 ml 10TBE 1.5ml 1m 50%甘油 1.5m 1m ddH2O 7.5ml 6ml APS 105ul 70 ul TEMED 12ul 12ul Total 15ml 10ml 310TBE 的配方：108g Tris 碱、55g 硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容 1L 4.变性 buffer 的配方 98%去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青 FF、0.025%溴酚蓝 注意事项：重复性.影响 SSCP 重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性.一般 SSCP 图谱是二条单链 DNA 带，但有时有的 DNA 片段 可能只呈现一条 SSDNA 带，或者三条以上，这主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的立体构象.有时三条以上的 SSCP 图谱是由于野型 DNA 片段和突变型 DNA 片段共同存在的结果.靶 DNA 序列长度的影响在实验中发现 SSCP 对短链 DNA 或 RNA 的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链 DNA 和 RNA 分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在 DNA 链较短的(400bp 以下)情况下，DNA 的长度不会影响 SSCP 的效果.电泳电压和温度的影响:为了使单链 DNA 保持一定的稳定立体构象，SSCP 应在较低温 度下进行(一般 4-15之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行 SSCP 时，开始的 5min 应用较 高的电压(250V)，以后用 100V 左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链 DNA 初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.SSCP 的结果断定:由于在 SSCP 分析中非变性 PAG 电泳不是根据单链 DNA 分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在 16-18cm 以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变 DNA 片段与正常 DNA 片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该 DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为 3mm，那么当两带间距离在 3mm 以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如 PCR 产物的上样量，PAG 的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具 体实验进行选择确定.