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Regulation of Hippo pathway transcription factor TEAD by p38MAPK-induced cytoplasmic translocationP38 MAPK诱导Hippo通路核心转录因子TEAD质转位（TEAD非Hippo途径调控）1.研 究 背 景2.论 文 思 路3.技 术 路 线4.结 果 详 解目 录/contents5.学 习 参 考研究背景1研究背景0104Hippo pathwayMst1/2,MAPK4Ks,Lats1/2YAP/TAZTEADnucleocytoplasmic shuttling020305理论基础科学问题?Hippo调控器官大小、癌症表型SMAD辅因子结合的转录因子核质穿梭调控TEAD核质穿梭控制尚不明确YAP/TAZ关键辅因子条件变化Hippo 通路YAP/TAZ去磷酸化、核转位下游：YAP/TAZ结合TEAD共激活下游转录Hippo上游：Mst/MAPK/Lats去磷酸化失活YAP/TAZ响应：去磷酸化活化Hippo 通路效应分子YAP葡糖浓度通过AMPK直接影响YAP活性Hariharan,I.K.(2015).Energy stress tames the Hippo pathway.Nature cell biology,17(4),362-363.AMPK敲除Hippo通路仍可响应能量水平表明AMPK对YAP活性调控存在代偿途径.YAP ser109位磷酸化被OGT介导的糖基化修饰取代Peng.C.(2017).Regulation of the hippo-YAP pathway by glucose sensor O-GlcNAcylation.Molecular cell,68(3),591-604.YAP存在多个Ser、Thr修饰位点（S占比10%T7%）.TEAD中S占比8%、T 4%转录因子TEADTEAD非Hippo依赖调控途径1（VGLL竞争抑制TEAD与YAP结合）TEAD非Hippo依赖调控途径2Lin,K.C.,Park,H.W.,&Guan,K.L.(2017).Regulation of the Hippo Pathway Transcription Factor TEAD.Trends in biochemical sciences.常规：依赖Hippo激活途径（YAP-TEAD形成复合体）论文思路2论文思路010203生物学问题？Hippo调控生物器官大小、癌症表型调控方式主要是转录调控哪些因子被遗忘？核心转录因子TEAD/YAPTEAD核质穿梭机制不明被遗忘的因子能否有新发现？TEAD的核质穿梭机制是否与YAP结合的其他转录因子不一致思路框架020304条件差异-表型鉴定筛选出特殊条件调控通路鉴定筛选出特异通路因子互作与调控分子机制生理功能关联回归生物学问题01技术路线3技术路线筛选压力应激压力：渗透胁迫为代表YAP质转位诱导因素：血清饥饿为代表表型差异通路筛选TEAD为核心：敲除p38与压力相关：通路抑制+p38敲除鉴定表型：wb检测p38、p-p38、TEADqPCR检测YAP/TEAD复合体靶基因免疫荧光检测TEAD、YAP核质穿梭通路鉴定因子互作TEAD序列分析：功能域分析IP检测：p38TEADYAP结合体外/细胞实验：TEADp38序列突变与体外表达IP检测结合序列突变+过表达+免疫荧光因子互作、调控因子调控TEAD/lats敲除qPCR检测靶基因免疫荧光检测Y/T血清饥饿/渗透胁迫wb检测YAP活化免疫荧光检测Y/T生理功能关联培养条件控制渗透压力/通路阻断YAP差异细胞系培养+成瘤生理功能结果详解4一一表型差异筛选1.诱导YAP与TEAD核质穿梭条件差异血清饥饿、葡糖饥饿等仅诱导YAP质定位压力胁迫诱导YAP/TEAD质定位.图1.ab盐胁迫时间效应 补充图1.a1hr-6hr质转位增加盐胁迫浓度效应 补充图1.b浓度增加质转位增加二二通路鉴定2.1 p38途径介导渗透性TEAD1转位p38不影响密度诱导TEAD转位.补充图1.cp38通路抑制导致盐诱导的TEAD/YAP质转位降低.图1.c过表达MKK3、p38诱导TEAD质转位.（右补充图1.d）p38通路抑制解除过表达MKK3、p38诱导的TEAD质转位.（左图1.d）2.2 p38各亚型诱导渗透压力TEAD转位p38通路抑制剂剂量效应.补充图1.ep38四亚型敲除.补充图1.fg 图1.f双敲不足以抑制p38功能p38敲除后TEAD1不响应盐胁迫.图1.e补充图1.h:p38敲除后无p-p38检出补充图ij:无盐胁迫敲除p38对TEAD/YAP影响较小2.3 p38是TEAD4转位的调控因子盐压力/血清饥饿通路不同.图1.ghp38仅与盐压力下的调控相关盐胁迫下p38与TEAD定位盐胁迫诱导TEAD质转位.图1.ip38活化先于TEAD转位.图1.jk结论：p38磷酸化活化是TEAD质转位降解的上游途径1hrp38信号是渗透压力诱导下TEAD转位的直接上游三三分子互作机制3.1 渗透胁迫下TEAD4与p38和YAP互作渗透胁迫下IP检测TEAD与p38/YAP的结合.图2.abc（细胞系）渗透胁迫诱导TEAD结合p38、解离TEAD与YAP结合TEAD4与MKK/p38互作.图2.dep38不与YAP互作.图2.f细胞系体外实验3.2 TEAD D功能域结合p38 CD/EDTEAD D功能域结合p38.图2.ghp38 CD/ED结构域结合TEAD.图2.ijk过表达CD/ED结构域缺失p38不诱导TEAD转位.图2.l细胞系体外实验3.3 p38调控盐压力下TEAD转位方式p38 KM敲除影响TEAD转位诱导.图2.mnKM敲除不影响结合但影响功能p38非磷酸化调控TEAD转位.补充图2.ae点突变TEAD磷酸化位点，检测p38结合与功能结论：p38控制TEAD渗透压质转位无需磷酸化TEAD3.4 CRM1介导TEAD4质转位p38调控TEAD转位需要信号肽通过CRM1介导.补充图2.fi突变TEAD信号肽、LMB抑制CRM1、NFAT5核转位对照3.5 渗透胁迫TEAD/YAP转位独立于Hippo渗透胁迫下血清不能对YAP去磷酸化.图3.ab渗透胁迫不影响血清恢复ERK磷酸化作为对照Lats敲除不影响TEAD/YAP转位.图3.cd.补充图3见下页血清处理为渗透胁迫对照3.5 渗透胁迫TEAD/YAP转位独立于Hippo3.6 p38通过TEAD介导YAPp38调控YAP靶基因图3.e.补充图3.gYAP核聚集依赖TEAD.图3.fgYAP正常去磷酸化但无核内聚集结论：YAP核积累必须去磷酸化并依赖TEAD，渗透压下p38控制TEAD质转位介导YAPp38-TEAD-YAP-靶基因TEAD质转位导致YAP不能核聚集敲除TEAD后YAP不能正常核聚集YAP核聚集激活需要磷酸化同时依赖TEAD核转位p38诱导TEAD质转位活化的p38诱导TEAD质转位，但不磷酸化TEAD，也不直接与YAP发生结合渗透压力诱导p38p38磷酸化先于TEAD质转位四四生理功能4.1 渗透性TEAD/YAP转位抑制生长MSTO-211H和H2373中YAP组成型去磷酸化但渗透胁迫下质转位、抑制生长.图4.abc.补充图4.ab左下4.2 TEAD-VP16恢复细胞生长过表达TEAD-VP16抵抗渗透胁迫下质转位和细胞生长抑制.图4.ce.补充图4.c渗透胁迫抑制YAP组成型去磷酸化UM细胞生长，推测靶标为TEAD.4.3 TEAD介导渗透压力应答两细胞系YAP特征.图4.f.补充图4.deGNAQ 92.1和 BRAF OCM1细胞系渗透压力诱发p38依赖的TEAD/YAP质转位.图4.g 补充图4.dg4.4 YAP驱动癌细胞对渗透性TEAD抑制高敏p38和渗透胁迫都显著抑制92.1类细胞.图4.h.补充图4.hMCF10过表达YAP响应渗透胁迫.补充图4.i92.1对渗透胁迫敏感.图4.i4.5 活化TEAD4拯救p38诱导拯救实验验证TEAD质转位是渗透响应核心.图4.jmp38过表达表型可通过TEAD-VP16恢复补充：TEAD是癌症治疗的潜在靶点渗透压力下TEAD在肿瘤组织中核定位，正常组织中质定位结论渗透压诱导TEAD质转位；渗透性TEAD质转位由p38介导、无需磷酸化；p38诱导TEAD质转位独立于Hippo途径132TEAD质转位抑制癌细胞生长4学习参考5转录因子课题模式激酶-转录因子-靶基因激酶对转录因子作用为核心，转录因子功能为辅助，适合于转录因子功能明确，下游靶基因明确，转录因子处于激酶途径网络，但转录因子本身调控研究不足的课题复合体-转录因子-靶基因复合体调控转录因子功能或者转录因子本身为复合体；以复合体结构、功能为研究核心，适用于相对复杂的转录过程研究泛素酶-转录因子-靶基因泛素酶对转录因子作用为核心，转录因子功能为辅助，适合于转录因子功能明确，下游靶基因明确，转录因子可泛素化，但调控机制研究不足的课题特殊靶基因-miR/LncR靶基因功能研究为主，转录因子上游调控研究为辅；适用于挖掘转录因子新的靶基因本文模式：激酶-转录因子激酶p38/MKK压力TEAD变化p38可介导压力p38是否调控TEAD转录因子TEADYAP/TAZ是TEAD辅因子YAP等以核质穿梭调控TEAD核质穿梭被忽略新通路：p38-TEAD-靶基因渗透压p38TEADYAP靶基因分子生物学实验分子调控模式预测|确定类型：转录、翻译、蛋白修饰等|根据类型分析分子结构、序列特征|位点预测-突变（位点突变、分子敲除敲入等）-功能验证-拯救|回到生物学问题验证功能可移植性解析实验对照十分严谨，值得深入学习分子机制研究是本文核心，既有完整的脉络又有精细的分子结构功能研究研究着力点清晰，所有研究都在围绕TEAD进行，避免了大量实验结果与主题无关的情况出现在技术上难度较低，使用的均为十分成熟的方法免疫荧光、IP、wb、qPCR等衍生、移植衍生、移植TEAD质转位分子机制？TEAD质转位分子机制？YAP核定位依赖TEAD的机制？YAP核定位依赖TEAD的机制？非YAP依赖癌症中TEAD作用？非YAP依赖癌症中TEAD作用？YAP质转位条件对TEAD功能影响？YAP质转位条件对TEAD功能影响？衍生、移植衍生、移植核心转录因子TEAD功能仍有研究空间，包括序列结构特征到功能比如TEAD与p38的结合域可以衍生TEAD与Hippo结合域YAP/TAZ需要结合TEAD共同作用，二者结合、调控上的差异，如何保证功能同步？序列、结构特征，对应的结合域，功能验证TEAD作为Hippo通路核心转录因子，存在非Hippo途径的调控模式，其上下游通路需要完善。同理，其他通路中同样存在因子功能多样性问题转录因子转录因子辅因子辅因子上下游通路上下游通路衍生定题问题：介导TEAD核质穿梭的信号是什么？基础：诱导YAP质定位的因素多数不能直接诱导TEAD转位；TEAD存在磷酸化、棕榈酰化修饰位点；YAP主要经磷酸化修饰核质穿梭，也有糖基化抑制磷酸化；TEAD棕榈酰化是正确折叠的基础，同时调控Hippo通路；p38不直接磷酸化TEAD；YAP核定位依赖磷酸化+TEAD核定位；渗透胁迫对YAP非依赖的癌细胞抑制作用不明显；思路：p38可影响TEAD核质穿梭，且p38磷酸化活化是TEAD质转位的条件，p38并非直接磷酸化TEAD，推测其磷酸化中介分子，TEAD出核需要信号肽核CRM1，推测中介分子与信号肽有关。衍生定题TEAD与多型癌症关联TEAD具有棕榈酰化酶活性、可自我棕榈酰化棕榈酰化对TEAD折叠具有重要意义，棕榈酰化位点与信号肽预测位置一致TEAD与CRM1关系未见报道p38与CRM1协同调控E2F1转位衍生定题信号肽修饰介导TEAD核质穿梭调控癌细胞命运TEAD信号肽存在棕榈酰化修饰TEAD信号肽脱酰基被CRM1识别TEAD核质穿梭影响癌细胞命运信号肽修饰-CRM1识别-TEAD核质穿梭-癌细胞命运感谢在座各位聆听感谢在座各位聆听