GST-pulldown(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 GSTGST-pulldownpulldown 实验实验 1 1.实验实验原理原理 利用重组技术将目标蛋白与 GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST 与固相化在载体上的 GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。分离所得的蛋白再进行Western blotting，即可检测与目标蛋白有相互作用的蛋白。例，验证蛋白质 A 和蛋白质 B 的相互结合作用。需要构建 A（或 B，即 A、B 选一个即可）与 GST 融合的重组质粒，然后通过 pulldown，把表达出来的 GST-A 融合蛋白拉下来（同时与 A 有相互结合作用的蛋白也会被拉下来），通过 Western blotting，用 B 抗体检测拉下来的蛋白，就能确定这些被拉下来的蛋白里是否有 B，如果有标明，A、B 存在相互结合作用。2 2.实验实验目的目的 体外验证蛋白质 A 与蛋白质 B 的相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用。3 3.实验实验材料材料 3 3.1.1 主要试剂主要试剂 Glutathione 琼脂糖珠、细胞裂解、细胞裂解等。3 3.2.2 主要仪器主要仪器 摇床、离心机等。解螺旋 http:/ 4 4.1.1 构建构建 GSTGST 融合目的蛋白融合目的蛋白 A A 重组质粒重组质粒（质粒（质粒 A A）并获得融合蛋白并获得融合蛋白 A A 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 1.将编码蛋白 A 与 GST 的重组质粒化转 BL21(DE3)菌株 2.挑取单个克隆到含有 5ml LB(100ug/ml Amp)的 10ml 试管里，37培养过夜 3.将培养菌液转移到含有 500ml LB(100ug/ml Amp)的 1L 锥形瓶中，37，225rpm 培养至 OD6001.0-1.5 左右，加入适当浓度的 IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10 分钟，4离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20放置过夜。解螺旋 http:/ 500ml 培养液加入 10-20ml 细菌裂解液（PBS 1%Triton-100 PMSF），吹打混匀。5.冰上超声破碎，开 2 秒，停 9 秒，总 40-60 分钟。至裂解液充分澄清。6.11000rpm，15 分钟，4离心分离上清，-80保存备用。4 4.2.2 真核融合蛋白真核融合蛋白 B B 的获得的获得 将编码 B 蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如 HA,或者 myc）的真核表达载体上（见分子克隆），进行细胞转染（见质粒转染）（此步可选，若目标细胞中，B 蛋白表达比较高，且比较好检测，则可以不用构建这个带标签的外源表达质粒转染细胞，直接用细胞裂解液即可）4 4.3.3 GSTGST-pulldownpulldown 1.取适量融合蛋白 GST-A 冰上冻融。2.取 50-70ul GST-Beads（Immobilized Glutathione）到 EP 管中，用 800ul PBS 1%Triton-100 润洗一次，将冻融融合蛋白 GST-A 与之混匀，4层析柜旋转结合 1 小时。3.PBS 1%Triton-100 洗 3 次，PBS 洗 3 次。留取 20l（PBS Beads）作 Offer。4.同时，裂解真核融合蛋白 B，去尽培养基，用 PBS(RT)洗一次，加入 300ul 裂解液（以6well 为例，PBS 1%Triton-100 Cocktaier），4放置 30 分钟。5.吹打收集至 1.5ml EP 管，超声破碎。13000rpm，15 分钟，4离心取上清。6.BCA 蛋白定量（optional）留取 20ul 做 Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的 EP 管中，用 PBS 补足液体到 600l 左右，以便蛋白之间能充分结合。4旋转结合过夜。7.PBS 1%Triton-100 洗 3 次，PBS 洗 3 次。8.40ul 5loading buffer 溶解 beads 上的蛋白，煮沸 3 分钟，高速离心，跑 SDS PAGE做 Western blotting 检测。用标签抗体 HA 或者 myc（若没有构建标签蛋白，则用蛋解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 白质 B 的抗体）进行 Blot。解螺旋 http:/ 5.应用示例应用示例文献文献1 1-4 4 1.Teoule F,Brisac C,Pelletier I,et al.The Golgi protein ACBD3,an interactor for poliovirus protein 3A,modulates poliovirus replication.J Virol 2013;8787(20):11031-46.2.Lou M,Liu Q,Ren G,et al.Physical interaction between human ribonucleotide reductase large subunit and thioredoxin increases colorectal cancer malignancy.The Journal of biological chemistry 2017;292292(22):9136-49.3.Lin Y,Bai L,Cupello S,et al.APE2 promotes DNA damage response pathway from a single-strand break.Nucleic Acids Res 2018;4646(5):2479-94.4.Selvakumar D,Drescher MJ,Drescher DG.Cyclic nucleotide-gated channel alpha-3(CNGA3)interacts with stereocilia tip-link cadherin 23+exon 68 or alternatively with myosin VIIa,two proteins required for hair cell mechanotransduction.The Journal of biological chemistry 2013;288288(10):7215-29.