RNA pulldown实验（生物素标记的磁珠法）(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 R RNA pulldownNA pulldown 实验实验（生物素（生物素标记的磁珠标记的磁珠法）法）1.1.实验原理实验原理 首先标记 RNA（如生物素探针标记 RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（western blot）或质谱（mass spectrometry）检测蛋白。解螺旋 http:/ 检测与 RNA（如 miRNA、lncRNA）相互作用的未知蛋白 3.3.实验实验材料材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 Pierce RNA 3 End Desthiobiotinylation Kit（Thermo 20163）DEPC 水 RNase 抑制剂 3.2.3.2.主要仪器主要仪器 PCR 仪 离心机 3.3.3.3.其他其他 体外转录的 RNA 片段 4.4.实验步骤实验步骤 生物素探针标记生物素探针标记 RNARNA 的的制备制备 a)取出 Pierce RNA 3 End Desthiobiotinylation Kit 试剂盒，打开 PCR 仪；b)用 DEPC 水溶解 RNA，用 DEPC 水溶解试剂盒中 Control RNA 作为阴性对照；c)取对照 RNA、目标 RNA 各 5 l,放于 PCR 管中，每管加 1 l DMSO，混匀后置于 PCR仪上，85 5min，取出立即置于冰上 5min;d)配制探针标记反应体系：解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 成分 体积（l）water 3 10X RNA ligase reaction buffer 3 RNase 抑制剂 1 Non-labeled RNA 5 Biotinylated Cytidine Bisphosphate 1 T4 RNA Ligase 2 PEG 30%15 Total 30 e)混匀，置于 PCR 仪内，16 过夜；f)取出 PCR 管，向每管中加入 400l DEPC 水;g)每管加 300 l 酚氯仿提取标记成功的 RNA，离心 15min,将上层水相移到新的 EP 管中。解螺旋 http:/ 抽提抽提 a)用 1ml 70%乙醇洗涤,8000rpm 离心 10min,吸净管内液体，空气中晾干 RNA；b)每管加 20 l DEPC 水溶解 RNA，后将 RNA 放于 PCR 仪中，95，5min，取出立即置于冰上备用。细胞裂解细胞裂解 a)弃去培养基，用预冷的 PBS 洗 3 次，吸去上清；b)每个培养皿中加入 200l 细胞裂解液；c)刮下细胞，将细胞悬液收集至 EP 管；d)4，3000rpm，离心 10min；e)转移上清至新的 EP 管中，置于冰上;f)取 10-20 l 左右上清至新管中，作为 input 组。磁珠磁珠预处理预处理 a)涡旋混匀 beads；b)每管取 400l beads，置于磁力架上，吸去上清；c)用 800l 1X binding&washing buffer,洗 3 次，吸去上清；RNA RNA 与与 beadsbeads 结合结合 a)向上一步的 beads 中加入 400l 2X binding&washing buffer；b)向上一步中加入 20l RNA,再补 380l DEPC 水，使其终体积为 800l；c)室温慢速旋转 20min,使 beads 与 RNA 充分结合；d)将上一步的管子置于磁力架上，吸去上清；e)用 800l 1X binding&washing buffer（含 RNase 抑制剂,1U/l）,洗 3 次，吸去上清；f)用细胞裂解液洗一次 beads,吸去上清。RNARNA 与蛋白相互作用与蛋白相互作用 a)向上一步已处理好的beads中每管加入500l细胞裂解液，同时向每管加入RNase 抑制剂 1U/l；b)4慢速旋转 2h,使 beads 与细胞裂解液充分结合；c)磁力架上吸去上清，用 400 l 新鲜配制的细胞裂解液，洗 5 次 beads;d)吸去上清，用 25l 预冷的 0.1%SDS 重悬 beads，加 6.25l 5X 蛋白上样缓冲液，95煮 10min，之后立即置于冰上 5min,再置于磁力架上吸取上清至新的 EP 管中，准备蛋白上样。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 蛋白的检测蛋白的检测 western blot 或质谱检测蛋白。解螺旋 http:/ 1 1 1.Jiang R,Tang J,Chen Y,et al.The long noncoding RNA lnc-EGFR stimulates T-regulatory cells differentiation thus promoting hepatocellular carcinoma immune evasion.Nat Commun 2017;8 8:15129.