mRNA-qPCR检测实验(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 qPCRqPCR 检测实验检测实验 1.1.实验原理实验原理 在单管 PCR 的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次 PCR 循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次 PCR 荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高，Ct 值越小。当维持 PCR 分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。解螺旋 http:/ 检查目的基因的 mRNA 表达水平。3 3.实验实验材料材料 3 3.1.1.主要试剂主要试剂（试剂来源仅供参考）（试剂来源仅供参考）试剂试剂 来源来源 Cat.No.Cat.No.Trizol Invitrogen 15596-026 三氯甲烷 Bio-Rad MSB1001 Nuclease-FREE Water Invitrogen AM9938 异丙醇 国药集团化学试剂有限公司 80109218 乙醇 国药集团化学试剂有限公司 10009218 DEPC 处理的水 碧云天 M-MLV promega M1705 dNTP promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Rnase Inhibitor promega N2115 GXD kit iqSYBR Green Bio-Rad 1708882AP 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 GXD 封膜 Bio-Rad MSB1001 PCR 无色薄壁管（平盖）AXYGEN US-PCR-02-C 3 3.2.2.主要仪器主要仪器（仅供参考）（仅供参考）解螺旋解螺旋 http:/ 来源来源 型号型号 离心机 Thermo Micro17R qPCR 仪 Biorad CFX96 酶标仪 BioTek Epoch-256600 电泳仪 上海天能 EPS-300 凝胶成像系统 上海天能 Tanon-600 3.33.3 qPCRqPCR 引物引物 一般可让公司设计，也可以自己设计，设计步骤详见解螺旋酸谈实验室（视频教程）。4 4.实验步骤实验步骤 （步骤 1-8 为细胞样品 RNA 抽提步骤（组织样品参见附件哺乳动物组织总 RNA 提取，其余步骤相同），步骤 9-13 为反转录制备 cDNA 步骤，步骤 15-17 为 qPCR 检测步骤）整个实验操作在超净工作台中进行，操作前对台面进行 20min 的紫外照射灭菌消毒，相关实验器材 75%乙醇擦拭消毒。除特殊说明外，所有的操作在室温的条件下完成。1.细胞样品的裂解：在 6 孔板中加入 1ml Trizol/孔，匀速吹打后室温静置 5min，转移至新的 1.5 ml Eppendorf 管中。2.每管加入 200 l 氯仿，用手振摇 Eppendorf 管 15 秒，室温静置 10min，4，12000 rpm，离心 15min。3.此时管内物质分成三层，使用 1000l 枪头吸取上层液体 400l，移至新的 1.5 ml Eppendorf 管，每管加入 200 l 氯仿，用手振摇 Eppendorf 管 15 秒，室温静置 10min，4，12000 rpm，离心 15min。4.使用 200l 枪头吸取上层液体 200l，移至新的 1.5 ml Eppendorf 管，加入与所取的上层水相等体积预冷的异丙醇，混匀后 4静置 10 min，4，12000 rpm 离心 10 min。5.此时管中出现白色沉淀，为实验需要的总 RNA，使用 1000l 枪头吸去上清。6.加入 1 ml 75%乙醇（用 DEPC 处理过的水新鲜配制），洗涤沉淀，4，10000 rpm 离心 5 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 min。7.使用 1000l 枪头吸去上清，4，10000 rpm 离心 5 min。8.用 20l 的枪头小心吸去残余的水分，室温干燥，待 RNA 基本透明时，加入 20l Nuclease-free water，至完全溶解，酶标仪测定所抽提 RNA 的浓度。9.将 1 l Oligo dT1(0.5g/l)和 2.0 g Total RNA 加入到 PCR 小管中，补充Nuclease-free water 至 10l，混匀后瞬时离心使液体聚集在管子底部。10.70保温 10 min，然后置于 4保存。解螺旋 http:/ PCR 管，在每个管中加入如下组分：试剂试剂 体积体积(l)M-MLV Buffer 4 dNTP 1.25 RNasin 0.5 M-MLV-RT 0.75 总量 6.5 12.混匀后，42保温 1 小时，4保存。13.酶标仪测定 cDNA 浓度，并调整浓度至 30 ng/l。14.按下列比例配置反应体系（20l/样品）：15.设定程序为两步法 Real-Time PCR：预变性 95，1 分钟；之后每一步变性 95，5S；退火延伸 60，20S；共进行 40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。Cycle 1:(1X)Step 1:95.0 for 01:00.Cycle 2:(45X)Step 1:95.0 for 00:05.Step 2:60.0 for 00:20.熔解曲线：PCR 结束后从 65开始到 95，每秒上升 0.5。试剂试剂 每管加入量每管加入量(l l)2SYBR premix ex taq 10 上、下游引物（各 2.5M）：0.8 cDNA 5 双蒸水 4.2 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 4 16.PCR 结束后可对数据进行分析，分析方法：2 2-CtCt。17.产物进行 Agrose 电泳。解螺旋 http:/ i.2g 琼脂糖加 200ml 1 TAE 电泳缓冲液，放入微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀；ii.待胶凉至 40-50 灌制琼脂糖凝胶板中。b)样品处理 i.在 qPCR 产物中加入 2l 的溴酚蓝 buffer 混匀。c)上样 i.每孔加入 7l 处理过的产物；ii.每排第一个孔加入 7l 的 250bp-maker。d)电泳 i.加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在 60-80V，电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约 2cm 时，停止电泳。e)染色 i.电泳完毕后移入 0.5g/mL 的 EB 溶液中，室温下染色 20-25min。f)观察和拍照 i.在波长为 254nm 的长波长紫外灯下观察染色后电泳胶板。ii.保存结果图片。解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 5 附件：哺乳动物组织总附件：哺乳动物组织总 RNARNA 提取提取 1.实验原理 在机械力和化学试剂的作用下破碎组织，提取组织总 RNA，用于 RT-PCR 等检测。解螺旋 http:/ 提取组织总 RNA 3.实验仪器 1.制冰机 2.TRIzol试剂 3.电动匀浆器；4.研钵；5.1.5 ml EP 管。4.实验步骤 1.准备好 EP 管，称取新鲜组织样本或液氮冰冻组织样本约 50100 mg，至于冰上；2.加入 1 ml TRIzol试剂；3.用电动匀浆器于室温破碎组织，液氮冰冻组织称取后立即于 TRIzol试剂中匀浆；不同组织之间需要用去离子水清洗电动匀浆器的探头，避免组织间交叉污染；4.匀浆后至于室温轮转 5 min，使组织充分裂解，期间可用枪头反复吹打促进裂解；5.加入 0.2 ml 氯仿，用手剧烈上下振荡 15 sec；6.室温静置 23 min；解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 6 7.4C 离心 12,000 g 15 min；8.上清水相移至一新 EP 管，加入 0.5 ml 100异丙醇，混匀后室温放置10 min 沉淀 RNA；9.于 4C 12,000 g 离心 10 min；10.1 ml 75乙醇洗涤沉淀 1 次；11.于 4C 7,500 g 离心 5 min;12.弃去乙醇，室温风干 510 min；13.RNA 沉淀溶于 2050 l RNase-free 水中；14.定量，测定 RNA 纯度(A260/280 ratio);5.注意事项 1.组织体积不可超过 TRIzol试剂的 10，否则容易有 DNA 污染；RNA 如不易于溶解，可至于 5560 C 水浴锅中 1015 分钟，促进溶解。解螺旋 http:/