结核分枝杆菌gyrA和gyrB基因突变与莫西沙星耐药水平关系.pdf

论著D O I:1 0.1 2 0 3 7/Y X Q Y.2 0 2 3.1 0-1 0结核分枝杆菌g y r A和g y r B基因突变与莫西沙星耐药水平关系孙海林1,任卫聪2,尚媛媛2,刘娟1(1.鄂尔多斯市第二人民医院 结核病重点学科,内蒙古 鄂尔多斯 0 1 7 0 0 0;2.首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 细菌免疫研究室,北京 1 0 1 1 4 9)【摘要】目的 研究莫西沙星耐药菌株的耐药相关基因突变特征,以及不同突变类型与莫西沙星最低抑菌浓度(m i n i-m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n,M I C)的关系。方法 选取2 0 1 92 0 2 1年鄂尔多斯市第二人民医院检验科(1 6 2株)和首都医科大学附属北京胸科医院细菌免疫室(1 0 3株)保存的结核分枝杆菌,采用微孔板稀释法检测这些菌株对莫西沙星的M I C,同时对莫西沙星耐药菌株的D NA拓扑异构酶亚基A(g y r a s e s u b u n i t A,g y r A)和D NA拓扑异构酶亚基B(g y r a s e s u b u n i t B,g y r B)基因进行测序,统计莫西沙星耐药率的差异。结果 本研究总计纳入2 6 5株结核分枝杆菌,所有菌株中对莫西沙星耐药8 2株,耐药率为3 0.9%。耐多药结核分枝杆菌(m u l t i d r u g r e s i s t a n t t u b e r c u l o s i s,MD R-T B)和非MD R-T B菌株中,莫西沙星耐药率分别为4 6.1%(7 0/1 5 2)和1 0.6%(1 2/1 1 3),MD R-T B菌株耐药率显著高于非MD R-T B菌株(P0.0 1)。在8 2株莫西沙星耐药菌株中,总计有5 9株(7 2.0%)和3株(3.7%)分别检测到携带g y r A基因突变或/和g y r B基因突变,最常见的突变在g y r A基因的9 4位点密码子(5 0.0%)。在g y r A和g y r B突变中,结核分枝杆菌的现代型(3 0.4%)和古代型(3 2.0%)差异无统计学意义;g y r A基因的9 0位点突变株、9 4位点天冬氨酸突变为酪氨酸以及丙氨酸菌株和g y r B基因突变株大部分表现为对莫西沙星低水平耐药(M I C2g/m l);而g y r A基因9 1位点突变株和9 4位点由天冬氨酸突变为甘氨酸以及丙氨酸引起高水平莫西沙星耐药,分别有7 5.0%、5 3.6%和4 6.2%的突变菌株(M I C2g/m l)。结论 g y r A基因的9 4位点突变是莫西沙星耐药菌株最主要的耐药机制,不同g y r A和g y r B突变类型导致对莫西沙星不同的耐药水平。MD R-T B菌株中有4 6%的菌株对莫西沙星耐药,提示在使用氟喹诺酮前有必要开展药敏试验,以期制订合理的治疗方案。【关键词】结核分枝杆菌;氟喹诺酮;莫西沙星;最低抑菌浓度;北京基因型R e l a t i o n s h i p b e t w e e n m u t a t i o n s o f g y r A a n d g y r B g e n e s a n d m o x i f l o x a c i n r e s i s t a n c e i n M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i sS u n H a i l i n1,R e n W e i c o n g2,S h a n g Y u a n y u a n2,L i u J u a n1(1.K e y D i s c i p l i n e s o f T u b e r c u l o s i s,T h e S e c o n d P e o p l e s H o s p i t a l o f O r d o s,O r d o s 0 1 7 0 0 0,I n n e r M o n g o l i a A u t o n o m o u s R e g i o n,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f B a c t e r i o l o g y a n d I mm u n o l o g y,B e i j i n g C h e s t H o s p i t a l,B e i j i n g T u b e r c u l o s i s a n d T h o r a c i c T u m o r R e s e a r c h I n s t i t u t e,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 1 1 4 9,C h i n a)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:S h a n g Y u a n y u a n,E-m a i l:4 9 6 3 6 6 6 4 9q q.c o m【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e m u t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f d r u g-r e s i s t a n t g e n e s a m o n g m o x i f l o x a c i n-r e s i s t a n t M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i s o l a t e s,a n d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n d i f f e r e n t m u t a n t t y p e s a n d m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n s(M I C s)a g a i n s t m o x i f l o x a c i n.M e t h o d s T h e M.t u b e r c u l o s i s i s o l a t e s w e r e e n r o l l e d f r o m c l i n i c a l l a b o r a t o r y o f T h e S e c o n d P e o p l e s H o s p i t a l o f O r d o s(1 6 2 s t r a i n s)a n d D e p a r t m e n t o f B a c t e r i o l o g y a n d I mm u n o l o g y,B e i j i n g C h e s t H o s p i t a l,C a p i t a l M e d i c a l U n i v e r s i t y(1 0 3 s t r a i n s)i n c l u d e d d u r i n g 2 0 1 92 0 2 1.M i c r o p o r o u s p l a t e d i l u t i o n m e t h o d w a s u s e d t o d e t e c t t h e s e s t r a i n s o f m i n i m u m b a c t e r i o s t a t i c c o n c e n t r a t i o n(M I C)a g a i n s t m o x i f l o x a c i n.A t t h e s a m e t i m e,m o x i f l o x a c i n-r e s i s t a n t i s o l a t e s w e r e s e q u e n c e d f o r g e n e t i c m u t a t i o n s i n g y r a s e s u b u n i t A(g y r A)a n d g y r B.T h e d i f f e r e n c e o f d r u g r e s i s t a n c e r a t e o f m o x i f l o x a c i n w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t w i t h P0.0 5.R e s u l t s A t o t a l o f 2 6 5 M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i s o l a t e s w e r e e n r o l l e d i n t h i s s t u d y,o f w h i c h 8 2 w e r e r e s i s t a n t t o m o x i f l o x a c i n,w i t h a d r u g r e s i s t a n c e r a t e o f 3 0.9%.I n m u l t i d r u g-r e s i s t a n t t u b e r c u l o s i s(MD R-T B)a n d n o n-MD R-T B s t r a i n s,t h e d r u g r e s i s t a n c e r a t e o f m o x i f l o x a c i n w a s 4 6.1%(7 0/1 5 2)a n d 1 0.6%(1 2/1 1 3),r e s p e c t i v e l y,a n d t h e d r u g r e s i s t a n c e r a t e o f MD R-T B s t r a i n s w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f n o n-MD R-T B s t r a i n s(P0.0 1).O f t h e 8 2 i s o l a t e s r e s i s t a n t t o m o x i f l o x a c i n,a t o t a l o f 5 9(7 2.0%)a n d 3(3.7%)w e r e d e t e c t e d t o c a r r y g y r A g e n e m u t a t i o n s o r/a n d g y r B g e n e m u t a t i o n s,r e s p e c t i v e l y,w i t h t h e m o s t c o mm o n m u t a t i o n s a t g y r A 6 7 中国医学前沿杂志(电子版)2 0 2 3年第1 5卷第1 0期通信作者:尚媛媛 E-m a i l:4 9 6 3 6 6 6 4 9q q.c o m论著g e n e c o d o n 9 4(5 0.0%).Am o n g g y r A a n d g y r B m u t a t i o n s,t h e r e w a s n o s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m o d e r n(3 0.4%)a n d a n c i e n t t y p e s(3 2.0%)o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s.g y r A g e n e m u t a n t s t r a i n 9 0,a s p a r t i c a c i d m u t a n t t y r o s i n e a t 9 4,a l a n i n e s t r a i n a n d g y r B g e n e m u t a n t s t r a i n m o s t l y s h o w e d l o w r e s i s t a n c e t o m o x i f l o x a c i n(M I C2g/m l).H o w e v e r,h i g h l e v e l s o f m o x i f l o x a c i n r e s i s t a n c e w e r e c a u s e d b y m u t a t i o n a t g y r A g e n e 9 1 a n d a s p a r t i c a c i d m u t a t i o n t o g l y c i n e a n d a l a n i n e a t g y r A g e n e 9 4,w i t h 7 5.0%,5 3.6%a n d 4 6.2%o f t h e m u t a n t s t r a i n s M I C 2g/m l,r e s p e c t i v e l y.C o n c l u s i o n s L o c u s 9 4 m u t a t i o n o f g y r A g e n e i s o n e o f t h e m a i n m o x i f l o x a c i n-r e s i s t a n t s t r a i n s o f r e s i s t a n t m e c h a n i s m,a n d d i f f e r e n t g y r A a n d g y r B m u t a t i o n s l e a d t o d i f f e r e n t r e s i s t a n t l e v e l f o r m o x i f l o x a c i n.4 6%o f s t r a i n s w i t h MD R-T B w e r e r e s i s t a n t t o m o x i f l o x a c i n,s u g g e s t i n g t h e n e e d f o r d r u g s e n s i t i v e t e s t b e f o r e t h e u s e o f f l u o r o q u i n o l o n e i n o r d e r t o f o r m u l a t e a r e a s o n a b l e t r e a t m e n t r e g i m e n.【K e y w o r d s】M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s;F l u o r o q u i n o l o n e s;M o x i f l o x a c i n;M i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n;B e i j i n g g e n-o t y p e 结核病仍是威胁全球的重大公共卫生问题。据世界卫生组织估计,2 0 2 1年全球有1 0 6 0万新发病例,因结核死亡人数估计1 6万人1,而中国新增7 8万结核病患者,是结核病高负担国家之一1。氟喹诺酮类药物是二线抗结核药物的重要组成部分,在人体内具有较好的杀菌效果,可有效缩短结核病患者化 疗 时 间2。其 中,莫 西 沙 星(m o x i f l o x a c i n,M F X)是治疗耐药结核病的氟喹诺酮类药物之一,作用机制与其他氟喹诺酮类药物类似,在结核分枝杆菌中的作用位点为D N A拓扑异构酶(g y r a s e,g y r),上述酶包括A和B两个亚基,分别由g y r A和g y r B两个基因编码3-4。前述研究表明,氟喹诺酮耐药的主要机制是由g y r A基因突变导致的5-6。目前,关于氟喹诺酮耐药与结核分枝杆菌g y-r A突变关系的报道较多5-6,而其中的MF X最低抑 菌 浓 度(m i n i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n,M I C)与g y r A和g y r B不同突变位点的关系报道较少,本研究选取结核病患者临床分离菌株为研究对象,分析MF X耐药菌株的g y r A和g y r B基因突变特征,以及不同突变类型与古代型和现代型分枝杆菌和MF X M I C的关系。1 材料和方法1.1 菌株 本实验所选取的2 6 5株结核分枝杆菌菌株,其中1 6 2株来自由鄂尔多斯市第二人民医院检验科,剩余1 0 3株来自首都医科大学附属北京胸科医院就诊的门诊和住院的结核病患者。所有菌株开展传统固体比例法药物敏感性试验,同时用硝苯甲酸和噻吩二羧酸肼进行菌种鉴定。标准菌株H 3 7 R v为国家结核病临床实验室保藏菌株。1.2 试剂来源 本试验所用改良罗氏斜面培养基购自于珠 海 贝 索 生 物 技 术 有 限 公 司;药 敏 试 验MF X药粉购自S i g m a公司,使用时按照厂家提供的纯度和效价计算用量;7 H 9培养基药粉和营养添加剂购自美国B D公司;A l a m a r b l u e显色剂购自美国B i o-R a d公司;2T a q预混液购自北京康为世纪生物科技有限公司;实时荧光定量聚合酶链 反 应(r e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,q P C R)试剂盒购自宝生物工程(大连)公司。所有引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。1.3 最低抑菌浓度测定 按照文献 7所述,采用微量稀释法进行结核分枝杆菌M I C检测。选取在改良罗氏培养基上生长34周的新鲜菌落,使用磨菌瓶分散均匀,并稀释菌液至1麦氏浓度,再以12 0稀释后向配置好相应浓度的药物微孔板加入1 0 0l菌液。加样微孔板于3 7孵育7 d后,再加入7 0l预混的显色液(含2 0l阿尔玛蓝和5 0l 5.0%吐温8 0),3 7孵育2 4 h,记录各孔的颜色,蓝色孔为无结核分枝杆菌生长,粉色孔为有结核分枝杆菌生长。能抑制结核分枝杆菌生长(蓝色孔)的最低药物浓度即为M I C。MF X药物浓度 设 置 为0.0 6 2 5、0.1 2 5、0.2 5、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、1 6.0、3 2.0、6 4.0g/m l,共1 1个药物浓度,关键 浓度为0.5g/m l,当M I C2g/m l时,定义为高浓度耐药8。1.4 基因组D NA提取 根据文献 7 所述,采用简单水煮法提取结核分枝杆菌基因组D NA。从改良罗氏培养基斜面上用接种环刮取结核分枝杆菌菌落,将菌落转移至装有1 m l生理盐水的无菌离心管中,8 0水浴3 0 m i n灭活,1 2 0 0 0g离心5 m i n去 上 清,用5 0 0 m l T r i s-E D T A缓 冲 液(p H 8.0)充分悬浮沉淀,1 0 0沸水浴3 0 m i n,冷6 8 中国医学前沿杂志(电子版)2 0 2 3年第1 5卷第1 0期论著却至室温后,1 2 0 0 0g离心5 m i n,取上清作为基因扩增模板。1.5 g y r A和g y r B基因扩增和测序 扩增M F X耐药相关基因g y r A基因片段和g y r B基因片段长度分别为3 9 8 b p和5 2 4 b p。g y r A基因上游引物序列:g y-r A-F-5 -G A T G A C A G A C A C G A C G A C G T T G C-3,g y r A基因下游引物序列g y r A-R-5 -G G G C T T C G G T G-T A C C T C AT-3,g y r B基因上游引物序列g y r B-F-5 -C C A C C G A C G C G A A A G T C-3,g y r B基 因 下 游 引物序列g y r B-R-5 -C T G C C A C T T G A G T T T G T A C A-3。扩增体 系 如 下:2T a q预 混 液2 5l,上 游 引 物0.2m o l/L,下游引物0.2m o l/L,基因组D N A 5l,剩余体积用d d H2O补齐到总体积5 0l。基因扩增条件如下:预变性9 4 5 m i n;循环9 4 1 m i n,6 0 1 m i n,7 2 1 m i n,3 5个循环;7 2 延伸1 0 m i n。基因扩增产物电泳检测后送北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果以标准敏感菌株H 3 7 R v基因序列作为标准,在B i o E d i t软件进行比对。1.6 定义 耐多药结核分枝杆菌(m u l t i d r u g-r e-s i s t a n t t u b e r c u l o s i s,MD R-T B)定义为对利福平和异烟肼同时耐药的结核分枝杆菌菌株。北京型和非北京型菌株利用R D 2 0 7基因缺失通过进行q P C R鉴 定 区 分,引 物:上 游 引 物5 -C AT G C G-G C GAT C T C AT T G T T-3,下游引物5 -G C A C T-G T T A C C C G C A C T T T C-3 和 探 针R O X-T G G-GAAG T A C C C T C C T G G G C-B HQ 2。现 代 型 和 古老型菌株利用I S 6 1 1 0片段是否存在之前描述的功能区域9通过q P C R鉴定区分,引物:上游引物5 -G C A G G A G A A G A T C G C A T G A T-3,下 游 引 物5 -G G A G G T C A A G T T C C A C A T C G-3 和 探 针F AM-C C A T C G G G C C A T T A A C C C T-B HQ 1。扩 增 体 系 如下:2 M i x预混液1 2.5l,上游引物0.0 2m o l/L,下游 引 物0.4m o l/L,探 针0.2m o l/L,基 因 组D N A 2l,剩余体积用d d H2O补齐到总体积2 5l。扩增条件如下:预变性9 5 5 m i n;9 5 1 5 s,6 2 3 0 s,7 2 3 0 s,4 0个循环。罗氏4 8 0 q P C R仪器自动绘制扩增曲线和溶解曲线。1.7 统计学方法 采用S P S S 1 8.0统计软件进行统计处理,不同患者特征MF X耐药率的比较采用卡方检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 莫西沙星耐药率的比较 本研究总计纳入2 6 5株结核分枝杆菌,其中对M F X耐药8 2株,耐药率为3 0.9%。根据不同患者特征分析M F X耐药率,如表1所示,在MD R-T B和非MD R-T B菌株中,M F X耐 药 率 分 别 为4 6.1%(7 0/1 5 2)和1 0.6%(1 2/1 1 3),MD R-T B菌株耐药率高于非MD R-T B菌株,差异有统计学意义(P0.0 1)。此外,北京型菌株耐药率为3 0.7%(7 4/2 4 1),与非北京型菌株3 3.3%(8/2 4)的耐药率无明显差异(P=0.7 9),其中,在北京型菌株中,现代菌株3 0.4%(5 8/1 9 1)耐药率和古代型菌株3 2.0%(1 6/5 0)差异也没有统计学意义(P=0.8 2)。表1 耐多药和非耐多药菌株中莫西沙星耐药率比较 株(%)项目合计(2 6 5株)莫西沙星耐药(8 2株)莫西沙星敏感(1 8 3株)P值耐多药结核分枝杆菌0.0 1 是1 5 2(1 0 0.0)7 0(4 6.1)8 2(5 3.9)否1 1 3(1 0 0.0)1 2(1 0.6)1 0 1(8 9.4)北京型2 4 1(1 0 0.0)7 4(3 0.7)1 6 7(6 9.3)0.7 9a 现代型1 9 1(1 0 0.0)5 8(3 0.4)1 3 3(6 9.6)0.8 2b 古代型5 0(1 0 0.0)1 6(3 2.0)3 4(6 8.0)非北京型2 4(1 0 0.0)8(3 3.3)1 6(6 6.7)注:a,北京型v s.非北京型;b,现代型v s.古代型。2.2 莫西沙星耐药的结核分枝杆菌菌株的g y r A和g y r B突变特征 对本研究中8 2株MF X耐药的结核分枝杆菌的g y r A和g y r B基因序列进行分析,如表2所示,总计有5 9株(7 2.0%)和3株(3.7%)分 别 检 测 到 携 带g y r A基 因 突 变 或/和g y r B基因突变。其中最常见的g y r A基因在9 4位密码子的突变(5 0.0%),包括天冬氨酸分别突变为甘氨酸(3 1.7%)、丙氨酸(1 1.0%)、天冬酰胺(4.9%)、酪氨酸(2.4%)。除9 4位点密码子突变外,9 0位点氨基酸是第二常见的突变类型,占全部耐药菌株的1 8.3%,且突变类型均为丙氨酸突变为缬氨酸。此外,3株(3.7%)MF X耐药菌株携带9 1位点丝氨酸突变为脯氨酸。而g y r B基因突变类型中有2株5 1 2位点甘氨酸突变为精氨酸、1株4 9 9位点天冬酰胺突变为苏氨酸,分别与g y r A的9 0位点的丙氨酸突变为缬氨酸、9 4位点的天冬氨酸突变甘氨酸和g y r A的9 4位点天冬氨酸突变为丙氨酸共突变。6 9 中国医学前沿杂志(电子版)2 0 2 3年第1 5卷第1 0期论著表2 莫西沙星耐药结核分枝杆菌g y r A和g y r B基因突变情况表耐药相关基因基因突变位点菌株数量 株(%)g y r A9 0位点氨基酸(A l a 9 0 V a l)1 5(1 8.3)9 1位点氨基酸(S e r 9 1 P r o)3(3.7)9 4位点氨基酸(A s p 9 4 G l y)2 6(3 1.7)9 4位点氨基酸(A s p 9 4 A l a)9(1 1.0)9 4位点氨基酸(A s p 9 4 A s n)4(4.9)9 4位点氨基酸(A s p 9 4 T y r)2(2.4)合计5 9(7 2.0)g y r B4 9 9位点氨基酸(A s n 4 9 9 T h r)1(1.2)5 1 2位点氨基酸(G l y 5 1 2 A r g)2(2.4)合计3(3.7)g y r A+g y r B9 0+5 1 2位点氨基酸(A l a 9 0 V a l+G l y 5 1 2 A r g)1(1.2)9 4+4 9 9位点氨基酸(A s p 9 4 A l a+A s n 4 9 9 T h r)1(1.2)9 4+5 1 2位点氨基酸(A s p 9 4 G l y+G l y 5 1 2 A r g)1(1.2)合计3(3.7)注:A l a,丙氨酸;V a l,缬 氨酸;S e r,丝氨 酸;P r o,脯 氨酸;A s p,天冬氨酸;G l y,甘氨酸;A s n,天冬酰胺;T y r,酪氨酸;T h r,苏氨酸;A r g,精氨酸。2.3 不同突变类型结核分枝杆菌现代型和古代型情况分析 现代型和古代型的菌株总计7 4株,3株耐药基因测序失败,共计7 1株。研究中结核分枝杆菌的现代型和古代型菌株的g y r A和g y r B突变率差异无统计学意义(P=1.0);g y r A基因中,9 0/9 1位点和9 4位点氨基酸突变率差异也无统计学意义(P=1.0),如表3所示。表3 不同北京基因型菌株中g y r A和g y r B基因突变的分布情况 株(%)基因突变位点菌株数量现代型 古代型P值g y r A有突变5 7(8 0.3)1 3(1 8.3)1.0 0a 9 0/9 1位点氨基酸1 8(2 5.4)4(5.6)1.0 0b A l a 9 0 V a l1 5(2 1.1)4(5.6)S e r 9 1 P r o4(5.6)0(0)9 4位点氨基酸3 9(5 4.9)9(1 2.7)A s p 9 4 G l y2 1(2 9.6)6(8.5)A s p 9 4 A l a1 0(1 4.1)3(4.2)A s p 9 4 A s n4(5.6)0(0)A s p 9 4 T y r4(5.6)0(0)g y r A无突变1(1.4)0(0)g y r B有突变4(5.6)1(1.4)1.0 0c 4 6 1位点氨基酸0(0)1(1.4)A s p 4 6 1 H i s0(0)1(1.4)4 9 9/5 1 2位点氨基酸4(5.6)0(0)A s n 4 9 9 T h r/G l y 5 1 2 A r g4(5.6)0(0)g y r B无突变5 3(7 4.6)1 3(1 8.3)注:a,g y r A有突变v s.g y r A无突变;b,g y r A的9 0/9 1位点突变v s.9 4位点突变;c,g y r B有突变v s.g y r B无突变;A l a,丙氨酸;V a l,缬氨酸;S e r,丝氨酸;P r o,脯氨酸;A s p,天冬氨酸;G l y,甘氨酸;A s n,天冬酰胺;T y r,酪氨酸;H i s,组氨酸;T h r,苏氨酸;A r g,精氨酸。2.4 不同突变类型菌株莫西沙星耐药水平分析 如表4所示,带有不同g y r A基因和g y r B基因突变的菌株对MF X耐药水平存在较大的差异。g y-r A基因的9 4位点天冬氨酸突变为酪氨酸、9 0位点突变 株 和g y r B基 因 突 变 株 大 部 分 表 现 为 对MF X低水平耐药,其低水平耐药菌株比例分别为1 0 0.0%、6 3.6%和6 0.0%;而g y r A基因9 1位点突变株和9 4位点天冬氨酸突变为甘氨酸以及丙氨酸 引 起 高 水 平MF X耐 药,分 别 有7 5.0%、5 3.6%和4 6.2%的突变菌株。g y r B基因突变类型中有1株5 1 2位点甘氨酸突变为精氨酸与g y r A的9 0位点的丙氨酸突变为缬氨酸共突变菌株引起MF X低水平耐药,而5 1 2位点甘氨酸突变为精氨酸与9 4位点的天冬酰胺突变甘氨酸共突变引起高水平耐药。此外,g y r B基因的4 9 9位点突变与g y r A的9 4位点的天冬酰胺突变丙氨酸共突变有5 0%为高水平耐药。3 讨论本研究基于鄂尔多斯市第二人民医院和首都医科大学附属北京胸科医院收集的结核分枝杆菌,开展了MF X相关耐药基因的突变特征研究,探索不同突变类型与MF X的M I C的关系。结果表明在MD R-T B菌株中,MF X耐药率(4 6.1%)高于福建 省(1 1.7 6%)1 0、重 庆 市(3 1.4%)1 1、西安市(3 4.2%)1 2,也高于我国2 0 0 7年结核分枝杆菌耐药率报道的结果(1 6.3%)1 3,说明我国的MF X耐药率明显呈现上升趋势,这与氟喹诺酮的滥用密切相关,也可能与不同地区耐药结核的流行特征不同有关1 4-1 6。最近MF X作为氟喹诺酮类药物归入治疗MD R-T B方案的A组药物1 7,本研究结果提示对氟喹诺酮类药物开展治疗前的快速药敏检测,对MD R-T B菌株的治疗十分重要,有利于选取更好的MD R-T B组合治疗方案。既往研究显示,结核分枝杆菌对氟喹诺酮产生耐药的主要基因突变为D N A拓扑异构酶g y r A1 8,g y r B发生突变要比g y r A少,与本研究结果一致。g y r A基因突变常见的有8 8位点、9 0位点、9 1位点、9 4位点突变2,本研究未发现8 8位点突变,突变主要集中在9 4位点。本研究结果表明,我国7 0.0%的M F X耐药的结核分枝杆菌菌株是由于g y r A7 0 中国医学前沿杂志(电子版)2 0 2 3年第1 5卷第1 0期论著表4 不同的g y r A和g y r B基因突变与莫西沙星耐药水平关系不同突变类型合计(株)高水平耐药菌株数 株(%)莫西沙星最低抑菌浓度(g/m l)0.2 5 0.5 1 2 4 8 1 6g y r A突变7 73 4(4 4.2)41 32 42 2534 A l a 9 0 V a l2 28(3 6.4)0775201 S e r 9 1 P r o43(7 5.0)0102100 A s p 9 4 G l y2 81 5(5 3.6)021 19132 A s p 9 4 A l a1 36(4 6.2)2235001 A s p 9 4 A s n52(4 0.0)1021100 A s p 9 4 T y r40(0)1120000 A l a 9 0 V a l+A s p 9 4 A s n10(0)0010000g y r B突变10(0)0100000 A s p 4 6 1 H i s10(0)0100000g y r A+g y r B突变42(5 0.0)0111001 A l a 9 0 V a l+G l y 5 1 2 A r g10(0)0010000 A s p 9 4 A l a+A s n 4 9 9 T h r21(5 0.0)0101000 A l a 9 4 G l y+G l y 5 1 2 A r g11(1 0 0.0)0000001注:A l a,丙氨酸;V a l,缬氨酸;S e r,丝氨酸;P r o,脯氨酸;A s p,天冬氨酸;G l y,甘氨酸;A s n,天冬酰胺;T y r,酪氨酸;H i s,组氨酸;A r g,精氨酸;T h r,苏氨酸。基因突变引起的,与之前来自于北京(6 8%)1 9报道的氟喹诺酮结果接近,但高于泰国(5 9.1%)2 0和突尼斯(5 0%)报道的数据2 1。导致上述差异可能是由于g y r A基因突变在当地的分子流行病学特点不同。g y r A基因的9 4位点天冬氨酸突变甘氨酸引起的MF X耐药率最高,可能与氨基酸性质差别有关,天冬氨酸为酸性氨基酸,甘氨酸为非电离的极性氨基酸,该位点的碱基突变可能导致空间发生改变,激活药物的外排泵,减少胞内药物累积,因此,研究g y r A基因导致氟喹诺酮耐药机制时,应考虑9 4位点天冬氨酸突变为甘氨酸的空间位点变化和基因的化学性质变化。而g y r B基因突变引起的耐药率比g y r A少很多,所以在开发适用于我国的新诊断试剂盒时应更加偏重于考虑g y r A基因突变。同时,2 9.3%耐药菌株没有发现突变,说明可能存在其他的氟喹诺酮耐药机制,需要进一步探索和研究。g y r A和g y r B的突变率在古代型和现代型的结核分枝杆菌中的分布无明显统计学差异,但在耐药水平研究中,g y r A的9 0位点和9 4位点氨基酸突变通常引起高水平耐药1 8,2 2,本研究结果表明,9 0位点丙氨酸突变为缬氨酸和9 4位点天冬氨酸突变为酪氨酸时,大多数菌株MF X的M I C低于2g/m l,9 0位点突变导致的结果与研究氟喹诺酮类中的氧氟沙星耐药的突变菌株和M I C关系保持一致7,很可能是由于丙氨酸和缬氨酸同属于非极性氨基酸,无论是结构和化学性质都具有相似性,因此,丙氨酸突变为缬氨酸没有引起g y r A与