维生素C制备大鼠成骨细胞膜片及其活性评估.pdf

20 医药前沿 2024年1月 第14卷第1期 论著维生素 C 制备大鼠成骨细胞膜片及其活性评估杨 红1，董 强2（通信作者），夏 茜3，周建奖4（1 贵阳市口腔医院口腔修复科 贵州 贵阳 550002）（2 贵州医科大学附属口腔医院口腔修复科 贵州 贵阳 550004）（3 贵州医科大学附属口腔医院口腔内科 贵州 贵阳 550004）（4 贵州医科大学贵州省医学分子生物学重点实验室 贵州 贵阳 550004）【摘要】目的：大鼠成骨细胞膜片的体外构建，通过形态学检测及增殖活性检测，评估其活性。方法：原代培养大鼠成骨细胞，纯化鉴定后体外构建成骨细胞膜片，用扫描电镜观察、组织学形态学检查，并测定厚度变化及细胞增殖情况。结果：经过5 d培养的成骨细胞连接成片，刮刀可刮下。HE染色见丰富的细胞外基质。扫描电镜观察到细胞层间有间隙孔。与正常培养的成骨细胞相比，细胞膜片第 1 周至第 2 周增殖迅速，第 2 周增殖活力最高。随着培养时间的延长，厚度增加，厚度在 1 周至 2 周显著增加，对照组直到 3 周才形成膜片，且厚度低于维生素 C 组。结论：维生素 C 促成骨细胞增殖形成细胞膜片，本方法可以稳定体外构建成骨细胞膜片，2 周内膜片厚度增加显著并且增殖活力较好。【关键词】细胞膜片；骨组织工程；维生素 C【中图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2024）01-0020-03Construction of rat osteoblast cell sheet with vitamin C and its activity evaluationYANG Hong1,DONG Qiang2(Corresponding author),XIA Qian3,ZHOU Jianjiang41 Department of Prosthodontics,Guiyang Hospital of Stomatology,Guiyang,Guizhou 550002,China2 Department of Prosthodontics,the Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China3 Department of Oral Medicine,the Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China4 Key Laboratory of Medical Molecular Biology of Guizhou Province,Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China【Abstract】Objective To construct osteoblast membranes from rat cells in vitro and evaluate their activity through morphological and proliferation assays.Methods Primary cultures of rat osteoblasts were established,purified,and used to construct osteoblast membranes in vitro.The membranes were observed via scanning electron microscopy and subjected to histological morphological examinations.Changes in thickness and cell proliferation were measured.Results Osteoblasts cultured for 5 days formed interconnected membranes detachable by scraping.Hematoxylin and eosin staining revealed abundant extracellular matrix.Scanning electron microscopy showed intercellular gaps.Compared to normally cultured osteoblasts,the proliferation of membrane cells was most rapid between the first and second weeks,peaking in the second week.Thickness notably increased with prolonged culture,significantly rising between the first and second weeks.The control group formed membranes only by the third week,with thickness lower than the Vitamin C group.Conclusions Vitamin C promotes osteoblast proliferation and the formation of cell membranes.This method enables stable in vitro construction of osteoblast membranes,with significant thickness increase within two weeks and good proliferation activity.【Key words】Cell sheet;Bone tissue engineering;Vitamin C细胞膜片技术是骨组织工程常用方法之一，膜片疗法受到广泛的研究1是目前较有前景的治疗方法。膜片包含完整的胞外基质等，无需支架即可直接移植到组织中2，在生物学特性等方面模拟细胞微环境，有利于移植。有报道维生素 C 诱导细胞片形成3-4，但细胞片的结构、形态、厚度变化和生存力仍未知。在原代培养的基础上，本实验扩增成骨细胞，体外培养细胞膜片，探究膜片内细胞活力情况及三维厚度变化，探索应用于移植再生骨的可能性。1 资料与方法1.1 实验动物和材料新生 SD 大鼠（贵州医科大学动物中心 SCXK（黔）2012-001）8 只；DMEM 高糖培养基、0.25%胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胶原酶型（Gibico公司，美国）；维生素C（Sigma公司，美国）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒 D-006（南京建成生物工程研究所）；ALP 试剂盒 A059-2（南京建成生物工程研究所）；茜素红（北京索莱宝公司）；MTT（北京鼎国生物技术有限责任公司）。1.2 成骨细胞分离培养及鉴定新生 SD 大鼠，脱颈处死，取出颅骨，剔除骨膜，剪碎。加入 0.25%胰蛋白酶消化 20 min，弃消化液；0.1%型胶原酶 2 mL，在 37 C 下消化 20 min，采集消化液，停止消化；反复进行 3 次消化；低温下，消化液离心弃上清，沉淀物吹打成细胞悬液，差数贴壁法纯化，高糖 DMEM 培养基（含 15%胎牛血清）培养，之后 2 3 d 换 1 次培养液，传代培养至第 3 代。细胞鉴定，采用茜素红、碱性磷酸酶染色（按照试剂盒说明书操作）。基金项目：国家自然科学基金项目（NS2018-64）；贵阳市科技局基金项目（GY2017-43）。医药前沿 2024年1月 第14卷第1期 论著 211.3 成骨细胞膜片构建取 2106/2第 3 代细胞接种于 6 孔板，连续培养，使用高糖培养基（含 15%胎牛血清、50 g/mL 维生素 C）培养。1.4 膜片扫描电镜观察第 2 周膜片于 0，25 mL/L 戊二醛固定 2 h，PBS清洗，乙醇梯度脱水，干燥，喷镀薄层金膜，镜下观察。1.5 细胞膜片 HE 染色及厚度检测取细胞片固定（4%多聚甲醛），脱水，包埋（石蜡），连续切片，HE 染色，显微镜观察 1、2、3 周的膜片组和对照组，用 Image-Pro Express 6.0 图像分析软件，采用200 倍视野，在（2 560 像素 1 920 像素）尺寸下，采集图像，同样像素和视野倍数下设标尺，随机选 5 点，测厚度取平均值。1.6 成骨细胞膜片增殖检测第 3 代细胞 2106/2接种 6 孔板中，实验组培养基添加 50 g/mL 维生素 C，连续培养 7、14、21 d 的两组样本，每孔加100 L MTT，孵育4 h（37），暂停培养，弃上清，加 600 L DMSO 振荡 15 min，每孔取 100 L移至 96 孔板，酶联免疫检测仪上测各孔在 490 mm 处的光吸收值，每孔取样 5 次，得平均值。1.7 统计学方法使用 SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料采用均数 标准差（x s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，三组间比较采用单因素方差分析。P 0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 成骨细胞观察鉴定细胞培养至第 3 代，胞质丰富，呈多个集落生长。ALP染色阳性：紫色胞核，胞浆棕色，内见深棕色颗粒图1（a）。茜素红染色阳性：见钙结节，橘红色图1（b）。（a）（b）注：（a）100；（b）200。图 1 原代培养的成骨细胞2.2 成骨细胞膜片形态学观察高密度接种第 3 代成骨细胞后连续培养 5 d，形成半透明状，细胞刮刀可分离的膜片，有褶皱收缩，呈奶白色；显微镜下 图 2（a）：膜片内细胞紧密连接，分布均匀。扫描电镜下：膜片致密，撕裂膜片，扫描内部图2（b）：膜片内存在一定空间，有间隙（箭头处）。组织学切片，HE 染色后 图 2（c）：膜片由 3 5 层细胞构成，排列紧密，有大量胞外基质。（a）（b）（c）注：（a）40；（b）200；（c）200。图 2 成骨细胞膜片形态2.3 膜片厚度检测膜片厚度测量（n=8）（图 3）：膜片厚度随培养时间延长而增加，第 2 周比第 1 周增厚明显（t=17.709，P 0.001），第 3 周高于第 2 周（t=4.649，P 0.05）；第 1 周到第 2 周厚度增加较明显，从（16.892.71）m增加到（38.442.11）m。第 3 周对照组形成膜片，且成膜厚度明显低（t=18.145，P 0.001）。2.4 细胞密度检测增殖实验（图4）：与对照组（1周：0.329 80.013 70，2 周：0.489 30.043 0）相比，第 1、2 周膜片组（1 周：0.467 80.019 6，2 周：1.152 60.081 2）细胞数量更 多（t1 周=3.944，t2 周=2.797；P1 周 0.05，P2 周0.05），第 3 周膜片组（0.692 00.150 8）少于对照组22 医药前沿 2024年1月 第14卷第1期 论著（1.179 20.077 8）（t=8.326，P 0.001）。膜片组中第 2 周 OD 值最高（P 0.001）。时间/周厚度/m图 3 厚度检测结果时间/周图 4 增殖实验结果3 讨论细胞膜片是组织工程的新思路，研究者们通过各种方法构建细胞膜片5，将细胞膜片单独或与支架复合移植来重建组织。细胞膜片是一种富含细胞外基质和胶原的细胞聚集体，厚度均一，具有一定韧性和强度。本实验结果说明：单纯利用大鼠成骨细胞可以稳定、快速地构建具有活性、有一定厚度的细胞膜片，并能简单地通过细胞刮刀收获。HE 染色观察到成骨细胞和其自身分泌的基质组成细胞膜片，由 3 5 层细胞组成，细胞连接紧密，其自身分泌的细胞质嵌入其中，丰富的基质可能由于维生素 C 刺激细胞外基质沉积有关3。电镜观察到：细胞膜片内存在一定间隙，估计可以通过这些空间交换氧气和养分。维生素 C 是一种有效清除自由基的天然抗氧化剂，可以抑制或减少细胞凋亡6，可以增强细胞的增殖4,7。有研究使用维生素 C 来构建干细胞膜片3-4。但干细胞分化为成骨细胞需要诱导，需要一定时间，直接用成骨细胞作为种子细胞，缩短培养周期，也有利于缩短膜片向成骨分化的时间。由种子细胞自分泌的胞外基质作为自源性支架对于细胞生物学性能的发挥将起到倍增放大作用。维生素 C 诱导细胞增殖及分泌大量胶原蛋白，缩短了成片时间。本研究结果显示：添加维生素 C，5 d即可培养出膜片，第 1 周至第 2 周膜片厚度增加明显，与细胞密度检测结果一致；第 2 周 OD 值最高，表明第2 周膜片内细胞数量多活性好，因此采用此方法构建的成骨细胞膜片 2 周内用于移植合理可行。未添加维生素C 常规培养，直到第 3 周才形成细胞膜片，第 1 周、第2 周细胞密度均低于膜片组，说明 2 周内维生素 C 促进膜片中成骨细胞增殖。第 3 周膜片厚度最厚但细胞活力下降，可能是随着细胞密度增加，没有血管输送营养，微环境细胞营养受限，空间不足所致。其他研究结果：吴镭等8将成骨细胞膜片在不同钛表面培养，初步证实了微粗糙的钛表面成骨细胞膜片的增殖、矿化良好。细胞膜片也存在一些缺点：培养周期长，容易收缩，厚度有限等，因此膜片血管化有待进一步研究。成骨细胞用来构建细胞片，可能可以用作治疗骨质缺损的天然三维结构，对于骨再生修复有重大意义，将来可能有更大的发展前景和应用价值。【参考文献】1 XUE F,BAI Y,JIANG Y,et al.Construction and a preliminary study of paracrine effect of bone marrow-derived endothelial progenitor cell sheetJ.Cell Tissue Bank,2022,23(1):185-197.2 LU Y,ZHANG W,WANG J,ET A L.Recent advances in cell sheet technology for bone and cartilage regeneration:from preparation to applicationJ.Int J Oral Sci,2019,11(2):17.3 YU J,HSU Y C,LEE J K,et al.Enhanced angiogenic potential of adipose-derived stem cell sheets by integration with cell spheroids of the same sourceJ.Stem Cell Research&Therapy,2022,13(1):276.4 ASHOK K,THOMAS B,MANJAPPA A B,et al.Characterization and evaluation of ascorbic acid-induced cell sheet formation in human periodontal ligament stem cells:An in vitro studyJ.Oral Biosci 2021,63(4):429-435.5 杨红，董强组织工程细胞片在牙周组织再生中的作用 J国际口腔医学杂志 2014,41:324-328.6 YANG M,TENG S,MA C,et al.Ascorbic acid inhibits senescence in mesenchymal stem cells through ROS and AKT/mTOR signaling J.Cytotechnology 2018,70(5):1301-1313.7 EVROVA O,KELLENBERGER D,CALCAGNI M,et al.Supporting cell-based tendon therapy:effect of pdgf-bb and ascorbic acid on rabbit achilles tenocytes in vitroJ.Int J Mol Sci,2020,21(2):458.8 吴镭，夏茜，毛久凤，等成骨细胞膜片在不同钛表面骨桥蛋白基因和蛋白的表达 J中国组织工程研究，2017,21(10):1501-1507.