肺腺癌中端粒相关lncRNA的表达及免疫相关分析.pdf

医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第3期doi:10.3969/j.issn.1673-5013.2024.03.009Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.339肺腺癌中端粒相关IncRNA的表达及免疫相关分析韦春浩1宿振国1刘相东 341（滨州医学院烟台附属医院检验科，山东烟台2 6 40 0 0)2（山东第一医科大学附属省立医院检验科，山东济南256200)摘要 目的：本研究致力于开发一种基于端粒相关长链非编码RNA（l n c R NA）的肺腺癌（LUAD）预后模型，以填补当前在高活性端粒酶作为肿瘤治疗靶点研究中的空白。通过综合分析端粒相关lncRNA的表达模式和临床数据，旨在构建可靠模型，预测LUAD患者的生存率和疾病进展，从而为个性化治疗提供精准指导。方法：通过癌症基因组图谱，（TCGA）数据库提取肺腺癌（LUAD）样本数据，包括长链非编码RNA（l n c R NA）表达谱和临床信息。采用共表达分析识别与端粒相关lncRNA，再通过Cox回归和LASSO回归分析构建 LUAD患者生存期风险模型。模型预测效力通过Log-rank检验和Kaplan-Meier分析评估。并使用GO和KEGG分析进行端粒相关lncRNA功能富集可视化。免疫浸润评估采用CIBERSORT算法，分析肿瘤组织中免疫细胞的分布。结果：本研究构建了一个基于端粒相关lncRNA的预测模型，该模型包括6 个预后相关lncRNA，它们在肺腺癌中的表达水平在不同风险组和临床模型中存在显著差异。高风险组的患者总生存（OS）时间显著缩短，且风险评分被验证为肺腺癌OS的独立预后因素。通过GSEA分析，揭示了与高表达基因相关的关键生物学通路，包括细胞周期、DNA复制和有丝分裂中的微管细胞骨架组织。免疫检查点分析表明PD-1、CT L A-4等基因在高风险组中表达水平显著不同，这一发现暗示针对肺腺癌患者，通过评估这些基因的表达情况，可以为实施个性化的免疫检查点阻断疗法提供依据。这表明，基于患者特定的基因表达模式，可以定制化免疫治疗方案，从而提高治疗的针对性和效果。结论：端粒相关lncRNAs风险模型具有准确预测LUAD患者预后的潜力，可作为未来潜在的治疗靶点。关键词】肺腺癌；端粒；预后模型；免疫浸润；生物信息学Expression of telomere-associated IncRNA in lung adenocarcinoma and its correlation withthe immune systemWEI Chun-hao,SU Zhen-guo,LIU Xiang-dong(Y antai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Shandong Yantai 264100)Abstract Objective:This research focuses on the development of a prognostic model for lung adenocarcinoma(LUAD),centeredaround telomere-associated long non-coding RNAs(lncRNAs).This initiative aims to bridge the existing research gap concerning thetargeting of highly active telomerase in cancer therapeutics.Through an in-depth analysis of the expression patterns of telomere-associatedIncRNAs and pertinent clinical data,the study seeks to establish a robust predictive model.This model is designed to accurately forecast thesurvival rates and progression of LUAD,thereby providing targeted and refined guidance for personalized treatment approaches.Methods:Lung adenocarcinoma(LUAD)sample data,including long non-coding RNA(lncRNA)expression profiles and clinical information,were extracted from The Cancer Genome Atlas(TCGA)database,Co-expression analysis was utilized to identify telomere-associatedIncRNAs,followed by the construction of a LUAD patient survival risk model using Cox regression and LASSO regression analyses.Thepredictive efficacy of this model was assessed through Log-rank tests and Kaplan-Meier analysis.Additionally,Gene Ontology(GO)andKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)analyses were employed for visualizing the functional enrichment of telomere-associated IncRNAs.Immune infltration was evaluated using the CIBERSORT algorithm,analyzing the distribution of immune cellswithin the tumor tissue.Results:This study developed a prognostic model based on telomere-associated long non-coding RNAs(IncRNAs)for lung adenocarcinoma(LUAD),incorporating six prognostically significant lncRNAs.These lncRNAs exhibited notablediferences in expression levels across various risk groups and clinical models in LUAD.Patients categorized in the high-risk groupdemonstrated significantly reduced overall survival(OS)times,and the risk score was validated as an independent prognostic factor forLUAD OS.Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)revealed key biological pathways associated with highly expressed genes,including cellcycle,DNA replication,and microtubule cellular skeleton organization during mitosis.Immune checkpoint analysis highlighted significantA通讯作者：刘相东，E-mail：x-l i u 16 3.c o m。.40expression differences in genes such as PD-1 and CTLA-4 in the high-risk group,suggesting the potential for personalized therapy throughimmune checkpoint blockade Conclusion:The telomere-associated IncRNAs risk model demonstrates promising potential in accuratelypredicting the prognosis of patients with lung adenocarcinoma(LUAD)positioning it as a prospective therapeutic target in futuretreatments.Key words Lung Adenocarcinoma;Telomere;Prognostic model,Immune Infiltration;BioinformaticsMedical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.3医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第3期肺腺癌（Lung Adenocarcinoma,LUAD）是全球最常见的肺癌类型之一，属于非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCL C）的亚型。这种癌症起源于肺部的腺体细胞，它们负责分泌肺部液体和粘液。肺腺癌特别是在吸烟者中普遍，但也是非吸烟者中最常见的肺癌类型。与其他肺癌类型相比，肺腺癌的发展通常较慢，并且可能在早期形成肺外围部位的肿瘤2。传统上，肺腺癌的预后因素包括TNM分期、肿瘤的大小、淋巴结侵犯程度以及是否存在远处转移3。随着分子生物标志物和基因组学的进展，越来越多基于分子特征的模型被开发来预测肺腺癌患者的预后，如基于表达的基因签名。这些分子特征不仅提供了预后信息，还有助于揭示癌症的发展机制，并为个性化医疗和靶向疗法的选择提供了科学依据。端粒构成了染色体末端的一段特殊结构，由重复的TTAGGGDNA序列和专门的庇护蛋白复合体构成。这一结构对于保持染色体的完整性与稳定性发挥着关键作用，而随着细胞周期的不断进行及在某些病理状态下，端粒的长度会逐渐缩短。端粒的异常状况与多种病症的发生有着密切关联，其中包括遗传性皮肤病、心血管疾病、精神健康问题以及多种形式的癌症。在肺腺癌中，端粒的作用尤为复杂。端粒，作为位于染色体末端的结构，不仅是维持基因组稳定性的关键元素，而且其长度的变化与肺腺癌细胞的生物学特性紧密相关8。端粒的逐步缩短在肺腺癌细胞的老化和细胞死亡中起着重要角色，限制了癌细胞的无限增殖潜力9。然而，癌细胞常通过激活端粒酶来维持端粒长度，从而逃避这种增殖限制，支持其恶性增长。此外，端粒缩短引发的基因组不稳定可能加速突变的积累，推动癌症的进展。因此，在肺腺癌中，端粒和端粒酶的状态不仅是肿瘤生物学和疾病进展的标记，也是潜在的治疗靶点，为开发新的治疗策略提供了有价值的线索。先前的研究集中于探讨端粒长度及其在癌症预后中的作用。端粒相关的IncRNA（如TERC和TER-RA）因其在维持端粒长度和调节癌症发展中的关键作用而受到关注14-15。这些lncRNA不仅对端粒的维护至关重要，而且在预测癌症预后、评估免疫治疗反应以及开发新的治疗策略方面显示出了潜力。特别是在膀胱癌和肾细胞癌中对端粒相关lncRNA 的分析揭示了它们在肿瘤免疫微环境调节、免疫治疗反应预测以及药物敏感性评估中的重要性，表明这些lncRNA可能作为癌症治疗中的潜在靶点，超越了传统生物标志物的角色。因此，我们通过构建一个端粒相关lncRNA的风险模型，旨在预测肺腺癌的预后，并进一步评估该风险模型在免疫治疗中的潜在作用。1资料与方法1.1数据集提取从TCGA（癌症基因组图谱）数据库（https:l/portal.gdc.cancer.gov）获取了与肺腺癌相关的RNA测序（RNA-seq）数据。纳人标准包括：确诊为肺腺癌；患者具备完整的转录组数据和临床信息。根据这些标准，我们纳入了530 例肺腺癌患者。此外，可从TCGA下载患者的完整临床信息。在筛选临床信息时，我们排除了随访时间少于30 天的样本。在进行注释时，我们选择了表达最高的基因作为基因符号，并使用注释包human.gtf 对其进行注释。1.2端粒基因获取端粒基因是从已发表达文献获取的8，一共得到2086个端粒相关的基因，用于后续的分析。1.3差异分析使用R软件的“limma、“p h e a t ma p”和“ggp-ubr”包进行差异分析，使用Wilcoxon秩和检验算法计算基因表达的显著性，并绘制火山图和差异基因的热图以全面展示肺腺癌模型中基因表达的差异情况1.4端粒相关lncRNA的筛选本研究采用皮尔逊相关分析法来识别与端粒基因医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第3期相关联的长链非编码RNA（I n c R NA），将IRI0.3和P0.001作为端粒相关lncRNA的筛选标准。1.5预后模型的建立首先，利用单变量Cox回归分析来评估lncRNA与预后之间的关系。在此分析中，选择P值小于0.0 5并在Kaplan-Meier生存分析中具有显著差异的lncR-NA。这些lncRNA被用来构建一个风险评分模型，该模型通过将IncRNA的表达水平与其相应的回归系数相乘并求和来计算。患者根据风险评分的中位数被分为高风险和低风险两组，并通过对数秩检验来比较两组的生存情况。1.6预后模型lncRNA和mRNA的关系绘制桑基图来探究预后模型中lncRNA和mRNA的关系。从Cox回归分析中筛选出危险比（HR）小于1的保护性基因和大于1的风险基因，并为网络数据添加相应的风险类型标。将数据转换为桑基图的形式，使用“ggplot2”和“ggalluvial”包进行绘制。1.7预后模型生存曲线和ROC曲线对风险分组进行了基于风险分数的排序，并利用排序结果绘制了风险分数分布图，通过绘制Ka-plan-Meier曲线，展示了在不同时间点上高低风险组的生存率，进行了受试者工作模型曲线（ROC）分析评估了模型在不同时间点的预测性能。通过计算AUC值，进一步验证了模型的可靠性和有效性。1.8独立预后分析(单多因素分析)使用R软件的“survival”和“survivalROc”包来进行生存分析和ROC曲线分析的操作。然后，定义了一个名为“bioForest”的函数，该函数用于绘制Cox回归分析的森林图，包含Hazardratio和p-value等信息。通过调用“bioForest”函数，分别绘制了单因素和多因素Cox回归分析的森林图，进行生存曲线的ROC曲线分析，其中包括risk score和每个基因的AUC值。1.9GSEA功能分析基因集富集分析（GSEA，h t t p:/w w w.b r o a d i n s t i-tute.org/gsea/index.jsp）是一种用于研究基因表达数据Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.3其中P0.05被认为具有统计学意义。2结果2.1差异分析利用TCGA数据，鉴定了19 8 6 2 个mRNAs和14695个lncRNAs，其中2 0 54个端粒基因在肺腺癌中表达。差异基因分析筛选出40 2 个表达差异基因，包括30 7 个上调和9 5个下调。热图（图1A）展示了这些基因在样本中的表达水平，颜色代表表达量（红色上调，蓝色下调）。火山图（图1B）展示了肺腺癌中的差异表达基因，以log2（FC）为横轴，-log10（P值）为纵轴，红点代表上调基因，蓝点代表下调基因，黑点表示无差异基因。A.41免疫检查点是调控免疫激活的关键分子，对防止自身免疫反应至关重要。为了深入理解模型在免疫细胞浸润方面的表现，我们利用CIBERSORT方法分析了免疫细胞的浸润情况，并设置了调整后P值小于0.0 5的标准来筛选结果，获取了免疫细胞浸润矩阵。通过使用R语言4.2.3版本的多个包（barplot、“corrplot、“g g p l o t 2 、“l i mma 、“r e s h a p e 2 ”、“g g-pubr、“b e e s w a r m），我们不仅对每个样本的免疫细胞浸润进行了条形图可视化，还分析了免疫检查点基因的表达差异，并探究了基因表达与免疫细胞浸润之间的关系。1.11 统计分析利用Kaplan-Meier方法生成生存曲线，并运用对数秩和检验进行比较。采用Cox回归和Lasso回归对端粒相关的lncRNA标志物以及临床病理数据对预后的影响进行估计。统计分析使用R语言（版本4.2.3）完成。通过t检验分析差异表达基因（DEG)，B(uploLbof-Voicano5功能富集的有力工具。我们运用GSEA来深入挖掘具有预后模型的功能富集情况，并通过直观的可视化呈现了与端粒相关的前5个基因本体论（GO）和基因组百科全书（KEGG）通路。这一分析帮助我们更全面地理解这些lncRNAs在生物学功能和通路上的关联，为深入解析其潜在生物学意义提供了重要线索。1.10免疫浸润和免疫检查点差异分析-5图1LUAD（n=530）和正常（n=59）组织样本之间差异表达端粒基因的热图（A）和火山图（B)。2.2端粒相关lncRNA模型的构建研究识别了156 5个与差异端粒基因相关的lncRNA。利用单变量Cox回归分析，筛选出了9 5个与肺腺癌（LUAD）患者预后有关的lncRNA。随后，通过LASSO回归分析优选出关键变量，随着入值的050.25KAnIsuesP0.00142增加，最终确定了32 个关键IncRNA（图2 A，B）。在此基础上，多变量Cox回归分析构建了一个包含6个lncRNA（L I NC 0 0 57 8、A L 6 0 6 48 9.1、A C 0 92 2 7 9.1、SH3PXD2A-AS1、A L 513550.1、C2 0 o r f 197）的 LUAD预后预测模型。通过热图，展现了这些IncRNA在不同风险组别及临床特征上的表达差异（图2 C)。使用Cytoscape 软件和R语言的“ggalluvial”包，对IncR-NA与mRNAs的共表达网络进行了可视化分析，揭示了部分lncRNA在调节过程中的关键作用（图3A，B)。研究发现，LINC00578、A C0 92 2 7 9.1、A L 513550.1和C20orf197可能作为抑癌lncRNA通过表达降低来减少生存风险，而AL606489.1和SH3PXD2A-AS1表达升高与生存风险增加相关，可能是促癌lncRNA。A92929090888884-8-6CMedical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.3-5Log2)医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第3期险。这个模型用系数加权的lncRNA表达水平来估算风险评分，正系数表明基因高表达增加癌症风险，负系数则表示低表达降低风险。患者根据风险评分中位数分为高风险组和低风险组，高风险组的总生存时间显著短于低风险组（P0.001）（图4A)。模型性能通过ROC曲线和AUC值（0.6 6 1，0.6 8 2，0.7 2 6）评估（图4B）。以1.0 39的风险评分中位数为阈值划分高低风险样本，散点图展示了随风险评分增加，死亡样本数量上升，进一步验证了风险评分在预测生存状态方面的应用价值（图4C，B)。ARikHorisk Lowrek1.000.750.50B92B89086LogLambdaH3PX64-534422-30.00Hghk2397475401912876432220000900Lowrisk2411928753372716105333320001234567891011121314151617181920Time(years)CHigh risklowRisk0DDeadAlive0237891011121314151617181920Timelyears)100AUC at 1 years:0.661AUC at 3 years:0.682AUC.at 5 years:0.7260.00.2200300Patients increasing risk socre)0.41-speificty4000.60.81.0detag04emaleACO1279.1图2 端粒相关lncRNA预测模型的构建(A）L A SSO 模型的调整路径图。（B）L A SSO 系数路径图。（C）6 个lncRNA 和临床病理学特征的热图。A图3（A）l n c R NA 和mRNA之间的网络关系。(B)桑基图。2.3LUAD患者的预测模型与预后之间的相关性风险评分模型通过结合六个IncRNA的表达水平和它们的系数，计算肺腺癌（LUAD）患者的癌症风0图4LUAD患者的预测模型与预后之间的相关性(A)高危组和低危组的Kaplan-Meier曲线结果。(B)子预测模型的1年、3年和5年生存率的ROC曲线和AUC。（C）风险曲线图。（D）生存状态图。2.4独立预后分析对肺腺癌（LUAD）患者的整体生存（OS）进行B评估时，结合临床模型的单变量与多变量Cox回归分析表明，风险评分是一个独立的预后指标。单变量分析揭示，N分期（风险比率HR=1.799,95%置信区间CI=1.463-2.212，P 0.0 0 1）、癌症分期（HR=1.662,95%CI=1.407-1.963，P 0.0 0 1）以及风险评分（HR=1.311，95%CI=1.2 0 4-1.42 8，P 0.0 0 1）均作为独立的预后因子。进一步的多变量分析确认了风险评分(HR=1.268，95%CI=1.16 7-1.37 7，P 0.0 0 1)作为独立预后因子的地位，而其他如M分期在单变量分析中显著但在多变量分析中不具独立预后价值（图5A，B)。利用时间依赖性接收者操作特征（ROC）曲线对模型的预测精度进行评估时，风险评分的曲线下100200Pafient(increasing risk socre)300400个免疫检查点抑制剂（ICI）基因进行分析时，关键医学检验与临床2 0 2 4年第35卷第3期面积（AUC）值达到了0.7 6 7，超过了其他临床因素的AUC值，从而证明了该模型在预测精度上的有效性(图5C)。Apualie0.60gender0.903sagr4G.00140.0010.05860.001saScon50.001图5用于评估6-lncRNA模型与个体临床病理因素的单变量和多变量Cox回归分析。训练队列中6-lncRNA模型的（A）单变量和（B）多变量Cox回归分析。（C）风险评分和临床病理变量的 ROC 曲线。2.5功能分析GSEA富集分析显示，在肺腺癌中，与高表达端粒差异基因相关的10 13个GO通路和50 个KEGG通Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.3Hatare ratieB0.996(0.978-1.015)n1.662(1.4071.963)stage1.615(1.296-2:013)1.788(0.981-3.259)1.79(1.463-2.212)1,311(1:2041,428)43.群体间表现出显著的差异性（P0.05），表明这些免疫细胞的浸润水平在不同风险组患者中的差异可能对预后和治疗反应产生影响（图7 A）。此外，对2 9Hazrdn04(0.85-1MNirskScor0.0051015202530HazardratioC80.0免疫检查点基因如PD-1和CTLA-4在高风险组中的9.979(0.657-1.530)268(1.1071,377)risksccage(AUC=0.477)Te(AUC=0.767)gender(AUC-0.459)T(AUC=0.604)age(AUC=0.649)M(AUC=0.531)N(AUC-0.614)0.20.4False positive rate表达水平呈现显著差异，这些基因在调控免疫逃避0005101520253.0Hazard rato0.60.8机制和塑造肿瘤免疫微环境中扮演着至关重要的角色(图7 B)。因此，这一发现为高风险肺腺癌患者提供了针对免疫检查点阻断疗法的个性化治疗策略的可能性。A0.51.00.40.2.Bp=0.0150.016900.793LowriskHigh riskp-0:8000m0.763-0.4Risk路被显著富集。其中，“细胞周期”、“DNA复制”和“造血细胞系”等KEGG通路与细胞增殖和生长紧密相关，表明这些通路可能促进肿瘤发展（图6A）。G O 分析揭示了与“有丝分裂中期板聚集”和“微管骨架组织涉及的有丝分裂”等生物过程，以及“钙黏蛋白结合”和“肽酶激活剂活性涉及凋亡过程”等分子功能的显著富集，暗示这些过程和功能在肺腺癌中的重要性（图6 B)。这表明，与高表达的端粒相关IncRNA可能在肿瘤增长、细胞周期控制、DNA复制、细胞分裂和调亡等关键过程中发挥作用，从而在肺腺癌的发展中扮演重要角色。AGG,ALLOCRAFT_REJECTKON图7 端粒相关lncRNA的高低风险在免疫浸润(A)，免疫检查点(B）差异3讨论肺腺癌（LungAdenocarcinoma）是最常见的肺癌B类型之一，属于非小细胞肺癌（NSCLC）的一种。它通常源于肺部的外围腺体组织，肺腺癌的发展速度ZATION_INVOLVED,N_MITOSIS较慢，且更可能在早期阶段就在肺部形成肿瘤，但早SESIGNALIN期可能无明显症状19。近年来，随着分子生物学的进展，越来越多的分子标记物和免疫治疗靶点被用于临床，为个体化治疗提供了可能2 0 。EGGPENTC图6基于端粒相关IncRNA的功能分析结果。(A)KEGG富集分析；（B）G O 富集分析。2.6免疫浸润和免疫检查的分析通过CIBERSORT方法对基因表达数据进行分析，本研究估算了2 2 种免疫细胞类型的浸润得分。结果显示，CD8T细胞、活化记忆T细胞、静息NK细胞以及单核细胞在高风险与低风险的肺腺癌患者EDU_APOPTOTICFROX我们建立的端粒相关IncRNA模型，包括LINC00578、A L 6 0 6 48 9.1、A C 0 9 2 2 7 9.1、SH 3PXD 2 A-AS1、A L 513550.1、C 2 0 o r f 19 7，它们可以联合起来作为 LUAD的独立预测指标。LINC00578 可能是胰腺癌的一个潜在预后标志物，这表明lncRNA在肺腺癌发展中可能很重要，虽然其确切作用机制还不清楚。AL606489.1是一个与铁死亡相关的预后标志物，其44在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中表达存在差异，并且与患者预后相关，表现为高表达的患者预后较差2 。AL606489.1的表达还呈现性别二态性，为探究肺腺癌中的性别差异提供了新视角2 3。在执行的GSEA富集分析中，细胞周期通路对肺腺癌细胞的增殖起着至关重要的作用，并与端粒缩短而引起的细胞衰老或死亡息息相关。肺腺癌细胞的持续分裂可能得益于某些lncRNA对细胞周期关键点的调节作用2 4。而且，尽管自身免疫性甲状腺疾病通路主要与甲状腺功能失调相关，但该通路中的基因也可能对肺腺癌的免疫响应产生影响，并在肿瘤的免疫逃逸机制中扮演重要角色2 5。同样，免疫相关的lncRNA在调控肺腺癌的免疫浸润和肿瘤微环境中也显示出潜在的作用。在肺腺癌治疗中，CD8+T细胞的高浸润度通常与较佳的预后联系在一起，因为这些细胞能够针对癌细胞发起攻击。然而，免疫检查点分子，例如PD-1和PD-L1，有可能抑制这些细胞的活性。免疫检查点阻断剂的疗效在很大程度上依赖于CD8T细胞在肿瘤微环境中的存在和活跃状态。此外，调节性T细胞（Tregs）能抑制免疫响应，并促进肿瘤的免疫逃逸机制，它们在体内的高含量往往预示着较差的预后2 。T细胞表面的 PD-1 与肿瘤细胞表面的PD-L1结合时，会削弱T细胞的作用，从而助长肿瘤细胞逃避免疫系统的侦测。PD-L1 的高表达已与肺腺癌患者的不良预后及免疫治疗反应的降低相关联2 7 。针对PD-1/PD-L1 通路的抗体疗法已在肺腺癌治疗中被采用，并已在部分患者身上取得了积极成效。本研究建立了一个肺腺癌预后模型，基于与端粒相关的lncRNA，但有一些限制。模型仅使用了TC-GA数据库的数据，可能不反映全球肺腺癌患者的多样性。尽管样本量较大，但还需要更多验证来确保模型的普适性。此外，可能存在选择和信息偏倚。我们主要使用统计和生物信息学方法，可能没能考虑到基因表达调节的复杂性。未来研究应该注意这些限制，并进行更全面的分析验证。4结论综上所述，我们构建了端粒相关IncRNA的新特征，可以独立预测LUAD患者的预后。本研究为端粒相关IncRNA与LUAD的可能机制提供了基础和潜在的预测意义，并可能有助于开发新的临床治疗方案。Medical Laboratory Science and Clinics,2024,Vol.35,No.3参考文献1 T-V Denisenko,Budkevich I-N,Zhivotovsky B.Celldeath-based 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