丁苯酞软胶囊对小鼠阿尔茨海默病学习记忆障碍的影响_苏洛漩.pdf

基金项目：年大学生创新创业训练项目，项目编号：。作者简介：苏洛漩（），女，辽宁抚顺人，在读本科生。通讯作者：袁春玲（），女，辽宁锦州人，副教授，博士学位，主要研究方向为神经药理学。丁苯酞软胶囊对小鼠阿尔茨海默病学习记忆障碍的影响苏洛漩，王义可，金春旭，袁春玲（锦州医科大学药学院，辽宁 锦州）摘要：目的 研究丁苯酞软胶囊对阿尔茨海默病（，）模型小鼠学习记忆障碍的影响。方法 采用小鼠侧脑室内注射 制备模型模拟 样症状，术后第 天开始灌胃给予丁苯酞，连续给药，第 天开始进行 迷宫、水迷宫行为学实验；法细胞检测；试剂盒检测小鼠海马焦亡标志蛋白 活性；方法考察海马炎症小体 的表达。结果 给予丁苯酞软胶囊治疗 可明显改善 所致小鼠 样症状，减少神经元焦亡及炎症反应。结论 丁苯酞可能会成为治疗 的候选药物。关键词：丁苯酞；阿尔茨海默病；焦亡中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（）（），；，：；阿尔茨海默病（）是一种复杂的多因素神经退行性疾病，是老年痴呆的最常见类型。其经典的神经病理学特征包括：细胞外 淀粉样蛋白（，）沉积形成的老年斑，细胞内由过度磷酸化 蛋白组成的神经原纤维的缠结，以及神经元丢失。关于 脑内神经细胞死亡方式的研究主要围绕着凋亡、坏死和自噬。焦亡作为体内一种程序性的坏死形式，近些年来也开始引起广泛关注。焦亡是在弗氏志贺杆菌作用于巨噬细胞过程中所发现的一种死亡方式。随着深入研究和技术发展，研究者们发现焦亡主要由 介导，而不是传统的凋亡相关反应分子。焦亡不仅仅发生在感染性疾病中，最近的研究表明，无菌性炎症中也存在焦亡，包括肝损伤、阿尔茨海默病、外伤性脑损伤等。丁苯酞（，）首次从芹菜种子中分离得到。它是一种合成的手性化合物，具有丁基苯酞 和 两种异构体。年，中国国家食品药品监督管理局批准该化合物用于脑卒中患者的治疗。丁苯酞是我国脑血管病治疗领域第一个具有完全自主知识产权的国家一类创新药物，其剂型包括注射液和软胶囊两种。近些年来，随着对 研究的深入，人们发现 不仅对缺血性脑血管病有效，还对肌萎缩性脊髓侧索硬化症、癫痫、阿尔茨海默病动物模型都有锦州医科大学学报 （）DOI:10.13847/ki.lnmu.2023.01.018治疗作用。据文献报道，能通过减少 淀粉样蛋白、蛋白的过度磷酸化，减少神经炎症，提高突触可塑性、抗凋亡及促神经新生等改善 动物模型的学习记忆障碍。丁苯酞对 动物模型神经元焦亡的影响，尚未见文献报道。本研究我们旨在评价丁苯酞软胶囊对诱导模型小鼠 样症状、细胞焦亡和焦亡相关信号通路的影响。材料与方法 仪器和材料动物脑立体定位仪（成茂，日本），水迷宫系统（中国医学科学院药物研究所，中国），酶标仪（赛默飞，美国），电泳仪（，美国），低温冰箱（中科美菱，中国）。丁苯酞软胶囊（石药集团恩必普药业有限公司，生产批号：，粒），盐酸多奈哌齐（卫材（中国）药业有限公司，生产批号：，片 盒），（，批号：）。侧脑室注射 致 小鼠模型的建立 小鼠，雄性，体重（），辽宁长生生物技术有限公司，合格证号，适应性饲养 ，腹腔注射 水合氯醛（体重）麻醉。小鼠侧脑室（前囟后 、矢状线旁 、颅骨表面下 ），注射 （含），缓慢推注，留针，假手术组注入等体积的生理盐水。分组及给药将小鼠分为 组，即假手术组、模型组、盐酸多奈哌齐 组、丁苯酞 组，每组 只。各组动物手术后第 天开始灌胃给药至行为学实验结束。丁苯酞软胶囊溶解于花生油中配制成 溶液，连续给药，第 天开始进行行为学实验，实验流程见图。图 实验流程图 水迷宫测试实验装置由一个直径 黑色圆形水池和一个可移动位置的黑色平台（安全台，直径）以及视频分析系统构成。水温（），水面高于平台顶端约 。定向航行实验：将小鼠面向池壁放入水中并开始计时，记录其找到安全台的时间（逃避潜伏期），动物上台后采集自动停止。若小鼠在 内未找到安全台，则逃避潜伏期记为 ，然后诱导动物到达安全平台并停留学习 。每天训练 次，连续训练 ，以每天 次潜伏期的平均值作为当天的成绩进行统计分析，整个实验过程中保持安全台的位置不变。空间探索实验：定向航行实验结束后，安全台移出水池，将小鼠面向池壁放入水池中，自由探索。记录 内动物在原安全台所在象限游泳的时间及穿台次数。迷宫测试 迷宫装置由夹角为 的、个臂组成。将小鼠放入 臂末端，内让其自由出入 个臂，并记录其进入 个臂的总次数（）及进臂顺序，以连续进入 个不同的臂为一次正确交替反应。自发交替反应率（）交替反应次数（）。染色行为学实验结束后，麻醉小鼠，每组 只，和多聚甲醛灌流取脑。将脑置于多聚甲醛中固定 后石蜡包埋，切片机切 冠状切片，按照 细胞凋亡两步法检测试剂盒（武汉博士德，）说明书操作。蛋白免疫印迹行为学实验结束后，麻醉小鼠，每组 只，断头取脑，液氮速冻后 保存。用时取出，裂解，定量后，将 脑蛋白加入 丙烯酰胺凝胶电泳，再依次转膜、封闭、加一抗过夜，室温孵育二抗 。试剂盒显影。（）条带分析。活性检测 活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，）基于可以催化底物 （）产生黄色的 （），在 附近有强吸收，酶标仪检测 活性。统计学方法采用 软件进行单因素方差分析（）或双因素方差分析（）。实验数据用均数标准差表示。以 为差异具有统计学意义。锦州医科大学学报 年 月，（）结 果 丁苯酞对侧脑室注射 小鼠学习记忆障碍的影响 水迷宫被用来评价小鼠的空间学习记忆能力。在训练期，与假手术组相比，模型组花费较多的时间寻找隐藏的平台。与模型组相比，多奈哌齐 组与 组明显降低，第天逃避潜伏期，见图。在 中，与假手术组相比，模型组小鼠目标象限游泳时间、穿台次数均显著降低；与模型组相比，多奈哌齐 组和 组目标象限游泳时间、穿台次数均显著增加，见图。丁苯酞对侧脑室注射 小鼠工作记忆障碍的影响 迷宫被用来评价小鼠的工作记忆能力。各组小鼠进臂总次数没有显著差异，表明各组动物运动功能无显著差异，见图。与假手术组相比，诱导小鼠自发交替反应率显著降低；多奈哌齐 和 可显著提高小鼠自发交替反应率，提示给药组小鼠工作记忆能力显著改善，见图。丁苯酞对侧脑室注射 小鼠海马神经细胞的影响 染色结果 显 示，与 假 手 术 组 相 比，诱导小鼠海马 阳性细胞数显著增加，丁苯酞可以显著减少 阳性细胞数，见图。丁苯酞对侧脑室注射 小鼠海马焦亡标志蛋白 活性的影响结果表明，与假手术组相比，模型组 活性显著增加；丁苯酞 治疗后 活性显著降低，且与假手术组无显著性差异，表明丁苯酞可恢复 导致的小鼠 活性升高，见图。：平均速度；：逃避潜伏期。与假手术组相比，；与模型组相比，图 丁苯酞对侧脑室注射 痴呆模型小鼠水迷宫定向航行实验的影响（）：目标象限游泳时间；：穿台次数。与假手术组相比，；与模型组相比，图 丁苯酞对侧脑室注射 痴呆模型小鼠空间探索实验的影响（）苏洛漩，等：丁苯酞软胶囊对小鼠阿尔茨海默病学习记忆障碍的影响：进臂总次数；：自发交替反应率。与假手术组相比，；与模型组相比，图 丁苯酞对侧脑室注射 痴呆模型小鼠工作记忆的影响（）与假手术组相比，；与模型组相比，图 丁苯酞对侧脑室注射 痴呆模型小鼠海马神经细胞的影响（）与假手术组相比，；与模型组相比，图 丁苯酞对侧脑室注射 痴呆模型小鼠海马 活性的影响（）丁苯酞对侧脑室注射 小鼠炎症小体 的影响结果表明，与假手术组相比，模型组小鼠 含量明显增加；与模型组相比，多奈哌齐 组和 组小鼠海马 含量明显降低，见图。锦州医科大学学报 年 月，（）与假手术组相比，；与模型组相比，图 丁苯酞对侧脑室注射 痴呆模型小鼠海马 蛋白的影响（）以上结果提示丁苯酞可能具有抑制 致小鼠神经元焦亡的作用。讨 论 是以进行性的记忆力丧失、认知下降和异常精神行为为特征的神经退行性疾病。最近已经被证实神经元的丢失与 患者学习记忆能力下降直接相关。神经元丢失及功能障碍会损伤突触并导致 患者认知障碍。此外，抑制早期神经元的死亡可减少晚期细胞外 沉积和认知障碍。研究证明，寡聚体的 可激活小胶质细胞内的 炎症小体，活化的 炎症小体在 的发生中发挥重要作用。被激活后，与其适配器 形成复合物，促进 的自催化活化，形成水 解 酶 活 性，继而裂解其下游效应物，加工 成成熟的形式，介导炎症形式的细胞程序化死亡称为焦亡。焦亡是一个高炎症形式的细胞死亡，其依赖于 的活性，对 细 胞 焦 亡 起 到 至 关 重 要 的 作 用。过 度 的 诱导的焦亡对机体是有害的。因此，靶向抑制 可抑制神经元的焦亡，提高 模型小鼠的学习记忆能力。年 被中国国家食品药品监督管理局认定为缺血性脑卒中的治疗药。它也被美国 批准用于缺血性脑卒中的 期临床试验。研究显示 不仅能明显减轻脑卒中急性症状，还具有强大的神经保护作用，并减轻血管性痴呆和 的认知障碍。的神经保护作用可能参与多条机制，包括改善微循环和 代谢，降低氧化应激损伤，减轻炎症反应和减少神经元凋亡。本研究证明 能减少 模型小鼠海马 的蛋白表达，降低 活性，继而减少大脑神经元细胞的焦亡，改善 模型小鼠学习记忆障碍。后续的研究我们将进一步探索长期给予 对 模型小鼠的改善作用及其机制。参考文献：，：，：，：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（），（）：（下转第 页）苏洛漩，等：丁苯酞软胶囊对小鼠阿尔茨海默病学习记忆障碍的影响马泛素 末端水解酶 表达的影响 现代预防医学，（）：，黄景玉，廖潇潇，张姗红，等 抑郁症患者血清微量元素、铜蓝蛋白与执行功能的关系 暨南大学学报（自然科学与医学版），（）：冯安琪，刘楠，朴美花，等 异氟醚对缺锌 转基因阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元凋亡的影响 吉林大学学报（医学版），（）：，房燚，李凌巍，姜涛，等 进食不同浓度锌对大鼠脊髓损伤抗氧化应激的作用 锦州医科大学学报，（）：，杨晓宇，武国栋，霍乃蕊，等 锌对镉染毒小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能损伤的抑制效应 中国兽医科学，（）：吴艺舸，王泽乾，殷丽君，等 小胶质细胞吞噬在阿尔茨海默病不同阶段的作用及其机制 中国病理生理杂志，（）：刘玥滢，杜天舒，刘玚，等 小胶质细胞介导的吞噬作用在神经退行性疾病中的研究进展 生理学报，（）：曾琪，俞梅琴，刘艳娟 过表达 调控 介导 小胶质细胞极化的机制研究 中国病理生理杂志，（）：官劲帆，安露露，韩江，等 利拉鲁肽通过 调控小胶质细胞 巨噬细胞极化改善糖尿病大鼠脑缺血损伤 陆军军医大学学报，（）：揭娟，杨莉，沈俊，等 右美托咪定抑制 核易位减轻大鼠创伤性脑损伤神经炎症 中华急诊医学杂志，（）：罗婕，王京琼，谢丽娜，等 自主跑轮运动通过 信号调控海马小胶质细胞极化抑制慢性应激所致大鼠抑郁样行为 生理学报，（）：刘婧昀，左群 锌转运体 和骨骼肌损伤修复的研究现状与进展 生命科学，（）：南楠，詹平 锌对砷致雄性大鼠睾丸毒性损伤的拮抗作用 上海交通大学学报（医学版），（）：房亚兰，尹洁，刘克建，等 脑缺血再灌注损伤中自由基与锌离子的相互作用 首都医科大学学报，（）：收稿日期：（上接第 页），（）：，（）：，：，（），（）：，（）：，（）：，：，：，？，：，：，（）：，（）：，：收稿日期：王喆，等：硫酸锌通过抑制活性氧促进 诱导的小胶质细胞向 型极化