电针对缺氧缺血性脑损伤小鼠...及促进神经可塑性的作用机制_乔梁.pdf

12Wang H，Sheng ZG，Dai LZ.Long non-coding NA LINC01503 pre-dicts worse prognosis in glioma and promotes tumorigenesis and pro-gression through activation of Wnt/-catenin signaling J Eur evMed Pharmacol Sci，2019;23(4):1600-913Wang M，Fang D，Di MP，et al Long non-coding NA LINC01503promotes the progression of hepatocellular carcinoma via activatingMAPK/EK pathway J Int J Med Sci，2020;17(9):1224-3414Gao J，Kang M，Han Y，et al Ginkgolides B alleviates hypoxia-in-duced PC-12 cell injury by up-regulation of PLK1 J Biomed Phar-macother，2019;115(1):108885-9515Li J，Wang T，Jiang XF.Inhibition of mi-337-3p involved in theprotection of CoCl(2)-induced injury in PC12 cells via activatingJAK2/STAT3 signaling pathwayJ J Cell Biochem，2019;120(11):19076-8616吴印华，胡万保.白藜芦醇通过激活 mTO/自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的 PC12 细胞损伤及凋亡 J 中医药临床杂志，2019;31(2):298-30317Buranjiang G，Kuerban，Abuduwanke A，et al MicroNA-331-3pinhibits proliferation and metastasis of ovarian cancer by targetingCC2 J Arch Med Sci，2019;15(6):1520-918Li X，Zhu J，Liu Y，et al MicroNA-331-3p inhibits epithelial-mes-enchymal transition by targeting ErbB2 and VAV2 through theac1/PAK1/-catenin axis in non-small-cell lung cancer J Canc-er Sci，2019;110(6):1883-9619Hui Q，Karlstetter M，Xu Z，et al Inhibition of the Keap1-Nrf2 pro-tein-protein interaction protects retinal cells and ameliorates retinalischemia-reperfusion injuryJ Free adic Biol Med，2020;146(1):181-820Xiao X，Lu Z，Lin V，et al MicroNA mi-24-3p reduces apoptosisand regulates keap1-Nrf2 pathway in mouse cardiomyocytes respon-ding to ischemia/reperfusion injuryJ Oxid Med Cell Longev，2018;(1):7042105-102021-11-12 修回(编辑苑云杰)电针对缺氧缺血性脑损伤小鼠抗神经细胞凋亡及促进神经可塑性的作用机制乔梁1李荣霞2胡山岗1(1 河南省中医院，河南郑州450002;2 青海省人民医院)摘要 目的探讨电针对缺氧缺血性脑损伤(HIBI)小鼠抗神经细胞凋亡及促进神经可塑性的作用及机制。方法将 80 只雄性 C57BL/6 小鼠随机分为假手术组、模型组、电针组和电针+转录因子 NF-E2 相关因子(Nrf)2 inhibitors 组，每组 20只。对模型组和电针组采用 ice 法进行 HIBI 模型建模，假手术组仅进行切口后缝合处理。电针组电针部位选取“内关”穴，频率为 2 Hz/100 Hz，电流终强度刺激为2 mA，2 次/d，每次持续时间为20 min，共计5 d。采用盲法进行小鼠的神经功能评分;采用 Morris 水迷宫测试对小鼠空间学习记忆情况进行考察;采用氯化三苯甲基四氮唑(TTC)染色法检测小鼠脑组织的梗死情况;采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记(TUNEL)染色法检测细胞凋亡情况;采用 T-PC 法检测 B 细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9 mNA 表达;采用蛋白免疫印迹法检测碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，突触后密度蛋白(PSD)95，突触小泡蛋白(SYP)，血红素加氧酶(HO)-1 和 Nrf2 的蛋白表达水平;采用免疫组化检测脑组织 Nrf2 和 HO-1 表达。结果与假手术组相比，模型组神经功能评分明显升高，逃避潜伏期明显延长，穿台指数显著降低，脑组织梗死面积比显著上升，TUNEL 阳性凋亡细胞数量明显增加，Bax和 Caspase-9 mNA 表达水平显著上调、Bcl-2 mNA 表达水平显著下调，bFGF、BDNF、PSD95、SYP、Nrf2 和 HO-1 蛋白表达水平明显降低，Nrf2 和 HO-1 蛋白阳性细胞数明显减少(均 P0.05)。与模型组相比，电针组神经功能学评分明显降低，Morris 水迷宫测试中小鼠的逃避潜伏期明显缩短，穿台指数显著升高(P0.05)，脑组织梗死面积比显著降低，TUNEL 阳性凋亡细胞数显著减少，Bax 和 Caspase-9 mNA 表达显著下调、Bcl-2 mNA 表达显著上调，bFGF、BDNF、PSD95 和 SYP 蛋白表达水平明显提高，Nrf2 和 HO-1 蛋白阳性细胞数明显增加(P0.05)。电针+Nrf2 inhibitors 组神经功能学评分明显低于模型组，明显高于电针组;Morris 水迷宫测试中逃避潜伏期较模型组明显缩短，较电针组明显延长，穿台指数明显高于模型组，明显低于电针组(P0.05);脑组织梗死面积比介于模型组和电针组之间;TUNEL 阳性凋亡细胞数量比模型组低，比电针组高;Bax、Caspase-9和 Bcl-2 mNA 表达水平、bFGF、BDNF、PSD95 和 SYP 蛋白表达水平及 Nrf2 和 HO-1 蛋白阳性细胞数都介于模型组和电针组之间(P0.05)。结论电针对 HIBI 新生小鼠具有抗神经细胞凋亡、抗氧化及促进神经可塑性作用，并对小鼠认知功能的恢复具有一定的神经促进作用，这些作用可能与介导 Nrf2 相关信号通路相关。关键词 缺氧缺血性脑损伤;电针;细胞凋亡;核转录相关因子 2中图分类号 651.1+5 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0715-06;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.051通信作者:李荣霞(1978-)，女，主任医师，主要从事重症医学研究。第一作者:乔梁(1975-)，男，主治医师，主要从事重症医学研究。在我国，缺氧缺血性脑损伤(HIBI)可导致不同程度神经功能障碍1。神经功能障碍的主要原因517乔梁等电针对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠抗神经细胞凋亡及促进神经可塑性的作用机制第 3 期有氧化应激、自由基损伤、神经细胞凋亡、细胞毒性等2，3。电针是在传统的针灸基础上进行改革创新，是利用结合电刺激发展起来的一种治疗技术。电针对脑缺氧缺血后导致的半暗带有很好的修复作用，改善脑能量代谢，并能明显改善患者后期的恢复情况，非常具有临床价值4。转录因子 NF-E2 相关因子(Nrf)2 介导的信号通路是机体防御性抗氧化的重要通路，Nrf2 可以对细胞抗氧化反应进行调节，并与抗氧化反应元件(AE)共同作用对抗氧化应激过程5，在生物体中的防御抵抗机制中扮演着举足轻重的作用5。本研究探讨电针法对 HIBI 雄性小鼠抗神经细胞凋亡及促进神经可塑性的作用及其可能机制。1材料与方法1.1实验动物80 只雄性 SPF 级 C57BL/6 小鼠购于河南省康华药业股份有限公司(许可证号:SYXK(豫)2017-0015)，体重(183)g，在本院动物实验中心进行饲养，自由饮食，实验中心的环境温度为(243)，相对湿度(505)%，每天12 h 循环光照。1.2药品与主要试剂PowerLab 生理记录仪(澳大利亚 AD Instruments 公司)，韩氏电针仪 HANS-200(南京济生医疗科技有限公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，水迷宫(东乐自然基因生命科学公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美国 Sigma公司，批号:T8877-25G);末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记(TUNEL)测定法试剂盒(美国 Sigma 公司，批号:S7110)，Nrf2 inhibitors(美国 TargetMol 公司，批号:M00240)，反转录试剂盒(美国 Sigma 公司，批号:K1622)，Trizol 试剂盒(TaKaa，批号:9108-1)，全蛋白抽提试剂盒(德国QIAGEN 公司，批号:37901)，Western 印迹试剂盒(美国 BD 公司，批号:SNM464)。1.3动物模型建立及分组将实验小鼠随机分为假手术组、模型组、电针组和电针+Nrf2 inhibitors组，每组 20 只。根据参考文献中描述的 ice 法建立 HIBI 模型6，对模型组、电针组和电针+Nrf2 in-hibitors 组建立模型:用戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，仰卧法固定，在颈中部消毒切开，分离左颈总动脉，采用 4-0 号手术线进行血管结扎，缝合伤口;2 h进行恢复后，将实验小鼠放入 37水浴中进行密闭缺氧环境处理，给予 8%O2+92%N2混合气体进行缺氧处理持续2.5 h。假手术组仅进行手术后缝合，不对其进行血管结扎和缺氧处理。参考实验针灸学，电针组选取部位为“内关”穴，双极电针为0.28 mm25 mm的针灸针制成，针刺深度为 1 2 mm，电针参数为:2 Hz/100 Hz，电流终刺激强度为2 mA，治疗时间 20 min，每天治疗 2 次，持续 5 d。电针+Nrf2 inhibitors 组在电针刺激结束后，向小鼠腹腔注射 Nrf2 inhibitors(ML385)30 mg/kg，1 次/d，持续5 d。造模成功标准:模型组小鼠的神经功能评分2 分。1.4小鼠神经功能评分采用盲法进行小鼠的神经功能评分。根据 Bederson 法7，抓取小鼠尾巴并把它抬高至离桌面 10 cm 处，观察各组小鼠形态并打分。标准:0 分:前肢是伸展状态(无神经功能损伤);1 分:对侧腕、肘屈曲，肩内收屈曲;2 分:前肢抵抗对侧推力的能力水平下降;3 分:对侧转圈。1.5小鼠空间学习记忆能力考察干预结束 7 d后，随机从每组中取 6 只实验小鼠，采用 Morris 水迷宫检测方法对实验小鼠的空间学习记忆能力进行检测。其中前 5 d 进行平台训练:平台高 30 cm、直径12 cm，然后放于迷宫的其中 1 个象限中，放入的水下深入为水下 1 cm 处;然后将小鼠分别放于 4 个方向，分 5 次进行 3 min 的探索直至找到平台，以小鼠到达平台的时间作为逃避潜伏期;若小鼠在 2 min内没有找到平台，则被引导至平台停留 15 min。从第 6 天开始为空间搜索阶段:将平台进行移除