AKR7A5基因敲除对雄性小鼠生殖的影响.pdf

书书书第 卷第 期烟台大学学报（自然科学与工程版）年 月 （）文章编号：（）：收稿日期：基金项目：国家重点研发项目（）。通信作者：石慧（），副教授，博士，主要研究方向为生殖学欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍氥氥氥氥。研究简报 基因敲除对雄性小鼠生殖的影响刘庆玲，赵振军，徐文秀，孔令英，刘笑含，许文达，董思琳，李岩，石慧（烟台大学生命科学学院，山东 烟台 ）摘要：通过分析野生型和 基因敲除型雄性小鼠的睾丸、附睾系数及其组织形态、精子活力和生育力，探讨 基因对雄性生殖系统的影响。结果发现：基因敲除型与野生型小鼠睾丸、附睾系数及其组织形态无明显差异；基因敲除型小鼠与野生型小鼠相比，其精子浓度、直线前游总数、直线运动精子、前向运动精子、平均路径运动速度和平均曲线运动速度显著降低，不运动精子显著增加（）；总产仔数显著降低（）。综上，基因敲除影响小鼠成熟精子的数量和活力，降低总产仔数。关键词：小鼠；基因敲除；生殖能力中图分类号：文献标志码：醛酮还原酶（，）是醛酮还原酶的第 个亚家族（，）成员 ，是 等 年从小鼠肝脏中鉴定出的一种新醛酮还原酶，其可将体内多种醛或酮还原为毒性较小或无毒性的相应的醇，从而保护机体免受有毒醛或酮的损害 。国内外对 的研究多集中在醛酮还原酶特性上 ，且研究仅限于体外细胞培养层面 ，在生殖方面研究较少。目前不孕不育率逐年升高 ，人类不育的遗传原因大多还不清楚 ，通过小鼠基因敲除模型可为揭示人类不育的遗传原因提供理论依据 。实验室前期的人附睾差异蛋白质组学研究发现，人 基因可能对睾丸、附睾精子有重要作用 。由于使用人类配子进行研究存在伦理和技术问题 ，且小鼠 与人 的氨基酸序列有 同源性 ，因此，本研究利用 基因敲除小鼠模型，在活体水平考察该基因对小鼠生殖的影响，为人类不育研究提供参考。材料与方法 试验动物 基因敲除型小鼠由山东大学惠赠。方法 小鼠基因型鉴定剪取小鼠尾尖，用动物基因组 快速抽提试剂盒（，碧云天）提取小鼠基因组 。基因鉴定使用两对引物，分别是 ：；：；：；：。反应体系（）如下：、第 期刘庆玲，等：?基因敲除对雄性小鼠生殖的影响 模板?、引物 （?）各?、加入双蒸水至?。反应程序为：预变性?；变性?；退火?；延伸?（个循环）；最终延伸?。产物经琼脂糖凝胶电泳后，于凝胶成像仪系统拍照观察。?基因敲除型小鼠可见引物 扩增出来的 条带，野生型小鼠可见引物 扩增出来的 条带，同时扩增出上述两种条带的小鼠即为杂合型。小鼠睾丸、附睾系数测定选择 月龄野生型和?基因敲除型小鼠各 只，称量其体重、睾丸重、附睾重。按照脏器重（）体重（）计算脏器系数 。睾丸、附睾组织切片及苏木精 伊红（）染色处死小鼠并分离睾丸和附睾，快速放入 多聚甲醛溶液中，室温固定 ，制备组织切片并进行 染色，显微镜下观察野生型与?基因敲除型小鼠组织形态差异并拍照保存。精子活力测定取野生型和?基因敲除型雄性小鼠各 只，断颈处死，将附睾迅速放进 预热的磷酸缓冲盐溶液中，用眼科剪将附睾尾部剪成几段，?孵育 。吸取?含小鼠精子的 溶液，采用计算机辅助精子分析仪分析精子的浓度和运动参数。生育力测定将 只?基因敲除型雄性小鼠（月龄）、只野生型雄性小鼠（月龄）分别与生育力正常的成年野生型雌性小鼠交配，按照雄性?雌性?的比例合笼。记录 个月的总产仔数、每窝产仔数及窝数以进行统计学分析。统计学分析本研究数据利用 软件，采用单因素方差分析方法处理，统计结果用平均值?标准差表示。当?，?表示差异有统计学意义。结果 小鼠基因型鉴定结果提取鼠尾 进行 扩增，电泳结果见图。、为?基因敲除杂合型小鼠合笼所生子代小鼠，其中小鼠 只出现一条约 的条带，为野生型；小鼠 、只出现一条约 的条带，为?基因敲除型；小鼠 、出现约 和 的两条带，为杂合型。?为 ；泳道 、以 为引物扩增，泳道 、以 为引物扩增。图 小鼠基因型鉴定结果 小鼠睾丸、附睾系数饲养过程中?基因敲除型小鼠的毛发、精神和活动量等生活状态良好。分别选取野生型和?基因敲除型种基因型雄性小鼠各只，各组小鼠睾丸和附睾系数见表 ，?基因敲除型小鼠睾丸、附睾系数与野生型小鼠相比差异无统计学意义（?）。表 小鼠睾丸、附睾系数 参数野生型?基因敲除型睾丸系数?附睾系数?睾丸、附睾切片为了进一步确证?基因敲除对小鼠睾丸与附睾组织发育的影响，利用组织病理切片 染色技术，观察分析 组基因型雄性小鼠的睾丸与附睾组织形态（图 ）。结果显示野生型和?基因敲除型雄性小鼠睾丸组织曲细精管均结构清晰，管壁基膜完整，各级生精细胞排列紧密规则，两者无明显差异（图 （）、（）。两种基因型小鼠附睾头和附睾尾的生精小管结构均正常，附睾尾管腔内具有成熟精子，但?基因敲除型小鼠附睾尾的成熟精子数量明显少于野生型小鼠（图 （）、（）、（）、（）。精子质量分析与野生型雄性小鼠相比，?基因敲除型小鼠的精子浓度、精子直线前游总数、直线运动精子、前向运动精子、平均路径运动速度和平均曲线运烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷动速度数值均显著降低（?）；平均直线运动速度数值降低（?）；不运动精子数值显著升高（?）；而两种基因型小鼠精子的非前向运动精子、平均头部侧摆幅值、精子平均鞭打频率、运动的直线性和运动的前向性等方面的差异无统计学意义（?）（表 ）。?图 两种基因型小鼠睾丸、附睾切片 表 两种基因型小鼠精子分析情况 参数野生型?基因敲除型精子浓度（个 ）?精子直线前游总数?直线运动精子?前向运动精子?非前向运动精子?不运动精子?平均路径运动速度（?）?平均直线运动速度（?）?平均曲线运动速度（?）?平均头部侧摆幅值（?）?精子平均鞭打频率（次）?运动的直线性?运动的前向性?注：与野生型相比较，?，?。第 期刘庆玲，等：基因敲除对雄性小鼠生殖的影响 生育力测定由表 可见，野生型小鼠平均每胎产仔数为 只，基因敲除型小鼠平均每胎产仔数为 只。个月内野生型小鼠和 基因敲除型小鼠产仔窝数相比差异无统计学意义（）；个月内 基因敲除型小鼠总产仔数比野生型小鼠显著降低（）。表 生育力测定结果 项目野生型 基因敲除型总产仔数 只 平均产仔数 只 窝数 窝 注：与野生型相比较，。讨论本研究发现 基因敲除可影响小鼠成熟精子的数量和活力、降低总产仔数 ，即 基因对小鼠生殖具有重要的影响。有研究报道精子易受活性氧等氧化代谢产物攻击，异常增多的活性氧介导氧化应激则可引起精子发生障碍、数量及活动度下降 ，酶可以减少活性氧的含量，从而对氧化应激的细胞有保护作用 。推测 基因敲除会造成生殖系统活性氧增多，引起精子的氧化损伤，进而对生育力造成影响。对于小鼠睾丸、附睾系数以及组织形态，发现 基因敲除型小鼠和野生型小鼠没有统计学意义。推测 作为 超家族的成员之一，其在组织中的功能可被其他成员代偿，例如 酶 和 酶 。综上，基因敲除影响小鼠成熟精子的数量和活力，降低总产仔数。其潜在的分子机制还有待于进一步研究。参考文献：，：，（）：，（）：燕宝华，杨文娴，朱晓峰琥珀酸半醛还原酶 的稳态动力学机理分析 四川大学学报（自然科学版），（）：，（）：，（），：，（）：，（），（）：孙文希，胡凌娟国内外不孕不育症现状及我国的干预策略探讨 人口与健康，（）：，（）：，：，（）：，（）：王超玄，孙航基因敲除小鼠技术的研究进展 生物工程学报，（）：，（）：吴庆懿，杨怀中人类生殖系基因编辑的伦理问题 基于桑德尔基因伦理思想分析 自然辩证法研究，（）：蒋莉基因编辑和人类生殖：社会伦理及法律规制 苏州大学学报（法学版），（）：田小芸，恽时锋，周森妹，等 、小鼠主要脏器重量及脏器系数的测定 中国比较医学杂志，（）：吴清洪，顾为望，张嘉宁，等 级 小鼠生长发育和繁殖性能指标的测定 中国比较医学杂志，（）：，丁豪帅，周昕，孔飞燕，等 信号通路在泌尿生殖系统疾病中的研究进展 西南国防医药，（）：，：烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷 ，：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（，）：，（），（）（），：；（责任编辑周雪莹）