雷帕霉素对细胞缝隙连接功能和连接蛋白表达的影响.pdf

基金项目:广东省医学科研基金(.)作者简介:魏尔婷女硕士生研究方向:药理学:.通信作者:汤南女博士教授研究方向:药理学:.雷帕霉素对细胞缝隙连接功能和连接蛋白表达的影响魏尔婷赵青钟意汤南(广东医科大学药学院广东 东莞)摘要:目的 观察雷帕霉素对人脐静脉内皮细胞、大鼠肝细胞 和小鼠肝细胞 细胞缝隙连接()功能及连接蛋白表达的影响 方法 采用 测定不同浓度雷帕霉素分别作用、和 后的细胞存活率筛选雷帕霉素不影响 种细胞生长的作用浓度采用细胞接种荧光示踪法和 检测不同浓度雷帕霉素对、的 功能及连接蛋白()和连接蛋白()的影响 结果、的雷帕霉素分别作用、细胞 对细胞生长无显著性影响 采用以上浓度的雷帕霉素分别处理细胞后与对照组相比可降低 在 间的荧光传递(.)并且雷帕霉素浓度为、时 细胞中的、和 细胞中的 蛋白表达显著性下降(.)结论 雷帕霉素作用、细胞后对不同细胞 功能具有一定的抑制作用并且可下调 和 的蛋白表达关键词:雷帕霉素细胞缝隙连接连接蛋白中图分类号:文献标志码:文章编号:():./.():()().(.)(.).:细胞缝隙连接()是由连接蛋白()组成的一种膜通道结构位于细胞膜上的 个 组成一个半通道(或称“连接子”)来自相邻细胞膜上的两个半通道对接组成一个 通道离子、小分子、第二信使等物质和信号可通过 在相邻细胞间扩散传递 作为组成 的基本单元有多种亚型形式 目前在人类中至少已鉴定出 种 亚型并依据其分子量大小进行命名 不同 组成的 通道对信号物质表现出一定的特异通透性因而可调节不同的生理功能 所介导细胞缝隙连接通讯在许多生物活动中至关重要如细胞增殖分化、免疫应答、神经活动等雷帕霉素()属于大环内酯类化合物是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶雷帕霉素机械靶蛋白药学研究 .()的 抑 制剂具有免疫抑制、诱导自噬、抗肿瘤等多种药理作用探讨雷帕霉素对 功能是否有调控作用可为其作用机制的研究提供参考 因此本实验在人脐静脉内皮细胞()、大鼠肝细胞()和小鼠肝细胞()上观察雷帕霉素对不同细胞 功能及 蛋白表达的影响 试验材料.细胞 人脐静脉内皮细胞()购自 公司大鼠肝细胞()和小鼠肝细胞()购自中国科学院.药品与试剂 雷帕霉素(公司)试剂盒(公司)(公司)内皮细胞培养基、生长因子及胎牛血清(公司)培养基(公司)完全培养基(中国科学院).胰酶和青链霉素(公司)抗体(公司)抗体(公司)抗体(公司)羊抗鼠二抗(公司)羊抗兔二抗(上海碧云天生物技术股份有限公司)其他试剂均为分析纯.主要仪器 荧光倒置显微镜(公司)酶标仪(公司)方法.细胞培养 采用内皮细胞专用培养基(含 胎牛血清生长因子及 青链霉素)采用 完全培养基(含 胎牛血清及 青链霉素)采用 完全培养基(含 胎牛血清、液体培养基补充剂及地塞米松)置于 、饱和湿度的细胞培养箱中常规培养采用胰酶消化传代.细胞活力测定 采用 法测定不同浓度雷帕霉素作用、和 细胞后对细胞生长的影响 细胞以的密度(/孔)接种于 孔板中置于 、细胞培养箱中培养 实验组分别加入、雷帕霉素作用 后(每组 个复孔)加入(/)溶液继续培养 用酶标仪检测 波长处的光密度值 与溶剂对照组比较计算实验组细胞的存活率.细胞接种荧光示踪法采用细胞接种荧光示踪法检测雷帕霉素对、和 细胞 功能的影响 细胞接种荧光示踪法为:取一孔细胞加入荧光试剂 孵育 作为“供体细胞”在细胞内经酯酶水解为具有 通透性的 将负载好荧光指示剂的“供体细胞”消化并稀释按 接种至已生长融合的“接受细胞”培养 倒置荧光显微镜下观察计数 个“供体细胞”周围含 绿色荧光的“接受细胞”数与溶剂对照组比较以荧光传递率作为 功能的评价指标将、和 细胞以 密度接种于 孔板中培养至细胞生长融合实验组分别加入、雷帕霉素作用 对照组采用溶剂处理 按上述细胞接种荧光示踪法评价细胞的 功能.采用 检测不同浓度雷帕霉素对、和 细胞 表达的影响 雷帕霉素作用细胞 后裂解细胞超声处理并在 的条件下离心 取上清进行蛋白定量 将 蛋白样品用 进行分离后转移到 膜上 在室温条件下用 脱脂牛奶封闭 后分别加入一抗 孵育过夜()然后在室温下加入二抗孵育 采用凝胶成像系统采集图像分析条带灰度值.统计学方法 采用 .软件进行统计分析 计量资料以 表示 组间结果比较采用 和 检验.)结果表明以上浓度雷帕霉素对、和 细胞无毒性作用 因此选择、作为后续试验的浓度.雷帕霉素对、细胞 功能的影响、雷帕霉素分别作用、和 细胞 后“细胞接种荧光示踪法”结果显示与溶剂对照组相比雷帕霉素组含 绿色荧光的“接受细胞”数量减少(见图)统计结果表明不同浓度雷帕霉素作用于、细胞后药学研究 .荧光传递率均显著性下降(.)并且当浓度为 时对 种细胞的 功能抑制作用达到最大(见图)以上结果表明雷帕霉素可降低 在、及 细胞间的传递对 种细胞 功能具有一定的抑制作用.雷帕霉素对、细胞 蛋白表达的影响 结果显示(见图)与溶剂对照组相比 及 的蛋白表达呈下降趋势并且当浓度为、时两种 蛋白表达量显著性降低(.)说明雷帕霉素对 及 蛋白表达具有一定的下调作用.作用于、细胞的荧光传递图.定量分析结果图 不同浓度雷帕霉素对、细胞 功能的影响注:与溶剂对照组相比.作用于 细胞.作用于 细胞.作用于 细胞图 不同浓度雷帕霉素对、细胞连接蛋白的影响注:与溶剂对照组相比.药学研究 .讨论 是细胞间传递信息和能量的重要通道之一由不同的 亚型组成 本研究中 细胞主要表达、和 细胞主要表达 和 细 胞 主 要 表 达 和结果显示在不引起细胞毒性的条件下雷帕霉素对 种不同的细胞 通道均表现出一定的抑制作用 是高度动态的结构其调控受到多种因素的影响如钙离子浓度、跨膜电压、翻译后修饰及 构象变化等可直接调节 通道的开启和关闭 基因转录后的蛋白表达数量及在细胞膜上的分布可引起质膜上 通道数目的变化 近年来的研究还表明 的降解和定位与自噬有关 内化后可与自噬运输蛋白或其他自噬相关蛋白相互作用经由自噬途径进行降解雷帕霉素作为常用的自噬诱导剂可通过抑制 活性促进细胞自噬 研究发现在 细胞中雷帕霉素可以抵消 引起的 蛋白表达的增加下调 的表达也可通过促进自噬的发展抑制由血管紧张素和 诱导的 表达和分布 本研究选择了实验细胞主要的 蛋白 和 作为检测指标结果表明雷帕霉素均可降低 和 的表达说明其对 具有一定的调控作用 雷帕霉素对 功能及 的下调机制与自噬诱导是否有关值得进一步的探讨 综上所述雷帕霉素对、和 细胞的 功能具有抑制作用并可下调 蛋白 和 的表达 这种对 通道的直接作用可能影响信号物质在细胞间的传递从而调控细胞生物学行为 本研究可为雷帕霉素的药理作用机制探讨提供参考参考文献:.():.:.():.:.():.():.():.():.():.():.():.():.:.():.()():.()():.李亮亮李冬娜任立成.抑制剂雷帕霉素的抗肿瘤作用.海南医学():.周秀张慧钟小宁.雷帕霉素及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()在免疫调节中的作用研究进展.细胞与分子免疫学杂志():.():.():.():./.():.(下转第 页)药学研究 .波长扫描选择最佳检测波长优选的最佳实验条件为:甲醇超声法提取样品色谱条件为色谱柱:色谱柱(.)流动相乙腈.磷酸溶液多波长切换:(新绿原酸、绿原酸)(白术内酯、)(白术内酯)(苍术酮)流速为.柱温为 进样量为 建立的 多波长切换指纹图谱测定方法稳定、可靠能够系统地分析白术土炒前后化学成分的变化规律对比色谱图可知土炒后 号峰、号峰(白术内酯)、号峰(白术内酯 )峰面积增加 号峰(新绿原酸)、号峰(绿原酸)、号峰、号峰、号峰、号峰(白术内酯 )、号峰(苍术酮)土炒后峰面积均降低 通过化学计量学分析 号峰(苍术酮)、号峰、号峰、号峰、号峰(白术内酯)为白术与土白术的显著差异性成分 白术可聚为一类土白术中、被归为白术一类其余土白术样品可聚为一类推测原因可能是这 批土白术炮制程度稍欠导致无法对白术与土白术进行有效区分 结果提示现有的炮制工艺尚不够精细炮制温度与时间需要进一步细化和规范以便更加有效保证土白术的质量稳定性 号峰为土白术重要的专属性成分试验中曾以羟甲基糠醛、隐绿原酸、异绿原酸等对照品进行了比对分析并查阅相关文献但仍未能其代表的化学成分 根据紫外光谱图推测该成分可能为小分子脂肪酸类成分课题组在后续试验中将进一步采用成分分离、纯化及结构鉴定等相关技术明确该成分同时结合药效学实验进一步研究白术与土白术功效差异与成分差异的关系参考文献:国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版(一部).北京:中国医药科技出版社:.孙星衍孙冯翼.神农本草经.北京:人民卫生出版社.王焘.外台秘要.北京:人民卫生出版社.马斯怡侴桂新.土白术药材中()十四癸二烯二炔二乙酸酯和芹烷二烯酮的定性定量方法研究.上海中医药杂志():.张乐林石典花孙蓉.白术生品与麸炒品 指纹图谱及主成分差异分析.辽宁中医杂志():.谭小娟李世雄李璎峪等.白术饮片的指纹图谱形状特征与质量标志物()研究.中草药():.张诚光孙冬梅毕晓黎等.不同产地麸白术指纹图谱及同时测定 种白术内酯成分含量的方法研究.广东药科大学学报():.张兵张丽娜韩鹏军等.白术中 种内酯成分的含量测定及指纹图谱研究.天津中医药大学学报():.盛云杰严斌俊穆朝峰等.基于指纹图谱与化学计量学评价白术炮制品质量.中成药():.杜晓蕾崔伟亮朱日然等.指纹图谱结合化学计量学研究白术麸炒前后成分变化情况.中药材():.山东省药品监督管理局.山东省中药饮片炮制规范(年版).济南:山东科学技术出版:.吴胜鸿黄圆圆周欣等.痔炎消颗粒 指纹图谱研究.中药新药与临床药理():.(收稿日期:)(上接第 页).():.():.():.:.():./.():./.():.(收稿日期:)药学研究 .