荻草谷网蚜两个内参基因的克隆及表达谱分析_张思宇.pdf

39(1)122-129 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2021-12-17 基金项目：国家自然科学基金（31672327，31871966）作者简介：张思宇，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，王文凯，博士，教授，E-mail：；范佳，博士，副研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2022.03.014 荻草谷网蚜两个内参基因的克隆及表达谱分析 张思宇1,2，于苗苗2，王文凯1*，范 佳2*，陈巨莲2（1.长江大学农学院，荆州 434000；2.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）摘要：利用染料法荧光定量 PCR 技术开展功能基因的表达量检测时，表达稳定内参基因的选择和引物的高特异性是确保检测结果准确可靠的前提。本文针对昆虫通用的内参基因 NADH（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase）和 DIMT（dimethyladenosine transferase）在荻草谷网蚜中进行了基因克隆、序列分析、不同龄期的时间表达谱分析和基因表达稳定性评估。两个基因的 GenBank 登录号分别为 OL770461和 OL770462。NADH 和 DIMT 基因克隆序列与基于高通量测序技术预测结果高度一致，但仍有不同。以-actin 为内参分析两个表达谱，结果显示各自表达稳定、龄期间无显著差异；稳定值由高到低为-actin，NADH，DIMT，稳定值彼此接近、远小于阈值 1.5。以上研究结果说明，通常作为内参基因的持家基因虽然保守，在物种间仍可能存在较大变异，直接引用其他物种的内参引物不可行；不但如此，一代测序技术虽然通量低但准确度极高，与之相比，二代高通量测序则错误率较高，因此引物设计使用的基因应首做克隆测序验证；最后，NADH 和 DIMT 在荻草谷网蚜各发育阶段表达稳定，适用于蚜虫基因、特别是不同发育阶段的基因表达差异分析。关 键 词：荻草谷网蚜；基因克隆；内参基因；表达谱；表达稳定性 中图分类号：Q96 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0122-08 Cloning and Expression Profiling of Two Reference Genes in Grain Aphid Sitobion miscanthi ZHANG Siyu1,2,YU Miaomiao2,WANG Wenkai1*,FAN Jia2*,CHEN Julian2(1.College of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434000,China;2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)Abstract:Stable expression reference genes are critical for accurate quantification of target genes expression by SYBR Green quantitative PCR.Suitable reference genes were screened among different developmental stages in the grain aphid Sitobion miscanthi.Two reference genes NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase)and DIMT(Dimethyladenosine transferase)were cloned and analyzed based on genomic annotation.Expression patterns among different developmental stages were measured and the expression stabilities were evaluated.The results showed that the sequences of SmisNADH and SmisDIMT were almost consistent with the prediction except one nucleotide acid.Homologous alignment showed that the matching aphid sequences were generally based on high-throughput sequencing and not verified by cloning,and the sequence differences between species were large.The GenBank accession Nos are OL770461 and OL770462 respectively.Both of their expression levels showed no significant differences among different instars and adult.Their stabilities ranked-actinNADHDIMT,but the values were close to each other and much lower than the threshold of 1.5.The above results show that although the housekeeping genes usually used as internal reference genes are conservative,there might still be large variations among species,and it is not feasible to directly use the 第 1 期 张思宇等：荻草谷网蚜两个内参基因的克隆及表达谱分析 123 internal reference primers of other species.In addition,although the first-generation sequencing technology has low throughput but high accuracy,the second-generation high-throughput sequencing has high error rate,so the genes used in primer design should be first verified by cloning sequencing.Further,the expression levels of NADH and DIMT are stable among instars as well as the adult stage,indicating that they are suitable as the reference genes to analyze functional gene expression in aphids,especially for analyzing the expression differences among developmental stages.Key words:Sitobion miscanthi;gene cloning;reference gene;expression profile;expression stability 荻草谷网蚜 Sitobion miscanthi 属半翅目 Hemiptera、蚜总科 Aphidoidea，是我国小麦生产上的重要害虫，在我国此前一直误称为麦长管蚜 Sitobion avenae1,2。对其基础生物学研究及绿色防控技术的研发是害虫防治领域乃至昆虫学科的重要议题。蚜虫与模式昆虫果蝇等进化关系上较远缘，且具备许多与之迥异的生物学特性，如不完全变态、孤雌生殖、伪胎生生殖方式、表型高度可塑性（体色、翅型等）、植物病毒传播介体、神奇的蚜蚁共栖等。这令有关研究富有吸引力的同时，因缺乏可参考的模式昆虫而极具挑战性。实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）因灵敏度高、重复性好和易于操作等优点，一直被普遍用于基因表达分析3。应用 RT-qPCR 分析功能基因在不同状态蚜虫或者蚜虫不同组织器官的表达模式，可为解析荻草谷网蚜的遗传进化、寄主选择以及抗药性等重要生命活动的调控机制提供思路。在实际应用中，RNA 质量、cDNA 的浓度、转录效率、聚合酶扩增效率等指标的变化等常规系统误差会导致错误甚至因此得出相反的结论4。选择内参基因进行标准化衡量、实现不同处理组间的表达量比较是染料法 RT-qPCR 的关键。为了减少样品间的误差，通常需要适宜的内参基因对靶标基因的检测结果进行校正，以便获得可靠的定量结果5,6。一个内参基因可以适用于多种处理条件下的样品，但不会保持绝对的稳定表达7-9。所谓稳定表达的内参基因通常只限定在一定条件下，如不同物种或同一物种的不同组织、不同发育阶段或不同环境胁迫条件等。因此，根据试虫情况选择合适的内参基因是保证获得具有重现性、可靠试验结果的前提10。蚜虫常用内参基因包括-actin（肌动蛋白基因），NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），18S rRNA（18S核糖体 RNA），16S rRNA（16S 核糖体 RNA），ACT1（肌动蛋白 1），GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）和 EF-1a（延长因子）等11-16，以及新内参基因 DIMT（二甲基腺苷转移酶）17,18等。蚜虫内参基因普遍存在根据高通量测序结果设计内参引物，甚至直接引用其他物种内参引物的情况。选择合适的内参基因对于荻草谷网蚜功能基因表达研究同样十分重要，而目前其内参基因的克隆验证、序列分析和表达稳定性评价均未见报道。内参基因的评估一般运用相关软件进行，但由于数据统计方法的差异，不同软件分析得到的候选基因稳定性和排名有一定差异19，因此在筛选内参基因时应结合多种软件分析，综合考虑内参基因的排名和稳定值，并进行试验验证以确保结果的可靠性。本研究对两个常用内参基因 NADH 和 DIMT 在荻草谷网蚜中进行基因克隆，并以各龄期若蚜以及成蚜为样本、以-actin 为内参引物，利用染料法 RT-qPCR 技术开展表达谱分析，最后利用 Ct 法20结合geNorm21和 NormFinder22两种软件对各候选内参基因表达的稳定性进行评估。基于序列比对和同源性分析结果，对不同物种内参基因是否有必要进行序列验证进行了讨论。研究结果为不同发育阶段功能基因表达谱分析工作中内参基因的选择提供参考依据，扩宽了内参基因的选择范围。1 材料与方法 1.1 供试虫源 荻草谷网蚜 Langfang-1 试验种群为孤雌生殖蚜型，单克隆试验种群。虫源来自河北廊坊，中国农业科学院廊坊实验基地试验田。具体从自然种群随机挑取单头无翅成蚜，接种到三叶期小麦苗上（中麦 175），经扩繁为试验种群。试虫饲喂于温度（252）、湿度（6010）%、光周期 16L:8D 的恒定条件中。1.2 样品收集 根据蜕皮次数判断龄期，分别收集荻草谷网蚜 14 龄若蚜和成蚜，置于 1.5 mL 离心管，若蚜每管 20头，成蚜每管 5 头。取样期间始终保持离心