滇重楼中皂苷的精制及其抗炎功效验证_余思宜.pdf

第52 卷第2 期 当 代 化 工 Vol.52，No.2 2023 年 2 月 Contemporary Chemical Industry February，2023 基金项目基金项目：北京市教委科技类一般项目，中药“扶正固本”方联合靶向脂质体抗耐药肺癌的研究（项目编号：KM201810017002）。收稿日期收稿日期：2021-11-03 作者简介作者简介：余思宜（1993-），女，云南省昆明市人，助理工程师，硕士，2018 年 8 月毕业于韩国东国大学食品生命工程专业，研究方向：食用药材的功效性评价和机理研究，E-mail：。通通信信作者作者：刘继涛（1985-），男，工程师，博士，研究方向：化妆品研究与开发。E-mail：。滇重楼中皂苷的精制及其抗炎功效验证 余思宜，钏定泽，刘俊红，刘平平，刘继涛*（云南白药集团股份有限公司，云南昆明 650000）摘 要：对滇重楼皂苷进行精制工艺优化，并对其精制组分进行抗炎功效的验证。采用正交设计研究上样量、径高比、洗脱液体积分数对重楼皂苷吸附和解吸的影响并优选动态洗脱条件，最终选择 SP825 大孔树脂、上样量 3 mgg-1树脂，径高比 110、洗脱剂体积分数为 70%乙醇溶液。然后利用不同质量浓度的重楼皂苷提取物对 HaCat 细胞紫外炎症模型中 IL-1、IL-6 和 IL-8 炎症因子质量浓度进行检测。结果表明，重楼总皂苷精制组分 C3 对 IL-1、IL-6 和 IL-8 炎症因子有显著的抑制作用。该工艺稳定可行，重楼皂苷精制物具有较好的抗炎效果，对于重楼的持续开发利用具有重要的参考价值。关 键 词：滇重楼；皂苷；精制；抗炎 中图分类号：R282.71;R285;R284 文献标识码：A 文章编号：1671-0460（2023）02-0277-08 Study on Refining Process of P.polyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.MazzSaponins and Verification of ItsAnti-inflammatory Efficacy YU Si-yi,CHUANG Ding-ze,LIU Jun-hong,LIU Ping-ping,LIU Ji-tao*（Yunnan Baiyao Group Co.,Ltd.,Kunming Yunnan 650000,China）Abstract:The refining process of Chonglou saponins was optimized and the anti-inflammatory effects of the refined components were verified.Orthogonal design was used to study the effects of sample loading,diameter-to-height ratio and eluent volume fraction on the adsorption and desorption effects of saponins and optimize the dynamic elution conditions.Finally,SP825 macroporous resin was selected and the sample loading was 3 mgg-1 resin,diameterto height ratio was 110,ethanol solution eluent volume fraction was 70%.Then,the massconcentrations of three inflammatory factors,IL-1,IL-6 and IL-8 in HaCat cell ultraviolet inflammation model,were detected with different mass concentrations of saponins extract.The results showed that the components of C3 had significant inhibitory effect on IL-1,IL-6 and IL-8.The process was stable and feasible,and the refined saponins of Chonglou saponins had good anti-inflammatory effects,and had important reference value for the development and utilization of Chonglou.Key words:P.polyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.Mazz;Saponins;Refining;Anti-inflammatory 滇重楼（P.polyphylla var.yunnanensis(Franch.)Hand.Mazz）是中药重楼的基原植物之一1，其干燥根茎为入药部位，主要分布在我国西南大部分地区。传统上，重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效2。现代研究发现，重楼具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、消肿止痛和止血等功效3-4，已广泛应用于临床，对治疗跌打损伤有独特疗效5，是“云南白药”6、“季德胜蛇药片”7和“宫血宁”8等多种中成药的主要原料之一。重楼的主要化合物包括甾体皂苷类、黄酮类、脱皮激素类、氨基酸类和脂肪酸类等，其中主要成分为甾体皂苷，占总化合物的 80%9-10。目前对重楼药理作用的研究主要集中于醇提取物，其中重楼皂苷是醇提取物的主要成分，而重楼皂苷又是重楼药理作用的主要活性成分11，具有较好的抗肿瘤活性，对胃癌、结直肠癌、肺癌和肝癌等多种肿瘤细胞增殖均有明显的抑制作用12-14。此外，重楼皂苷还具有良好的抗炎活性，重楼醇提物对二甲苯所致的耳廓肿胀及醋酸所致的毛细管通透性增加有明显的抑制作用15；重楼皂苷 H 和总皂苷使血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力升高，使丙二醛（MDA）和前列腺素 E2（PGE2）的含量降低16，从而产生良好的抗炎活性。因此，重楼皂苷的提取精制工艺对进一步研究以及开发重楼相关的产品具有重大意义。本研究利用正交试验法优化滇重楼皂苷的动态洗脱条件，并分析不同精制物组分的抗炎功效，最终确定滇重楼皂苷的最佳精制工艺，为滇重楼皂苷的有效利用和开发提供参考。DOI:10.13840/21-1457/tq.2023.02.011 278 当 代 化 工 2023年2月 1 实验部分 1.1 材料与仪器 滇重楼采自云南，由云南白药健康产品有限公司提供；无水乙醇、硫酸、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等，北京化工厂；重楼皂苷 I 对照品、茴香醛、CCK-8，大连美仑生物技术有限公司；地塞米松，美国 Sigma 公司；AB-8、D101、H103、SP825、HP-20 大孔吸附树脂，沧州华众环保科技有限公司；DMEM 培养基、双抗、胎牛血清（Gibco）；25 瓶/75 瓶/225 瓶/96 孔板/48 孔板/6 孔板/60mm 15mm 培养皿（康宁）；TNF-酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒、IL-6 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒、IL-8 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（Solarbio）。BSM200 电子分析天平，上海卓精电子科技有限公司；RE 52-86A 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；UV2600 紫外-可见光分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；311 直热式 CO2细胞培养箱，美国 Thermo Fisher 公司；Centrifuge 5418 R 冷冻高速离心机，德国 Eppendorf 公司；CKX53SF 倒置显微镜，日本 OLYMPUS 公司；HBS-1096A 酶标仪，南京德铁实验设备有限公司；SW-CJ-1D 单人净化工作台，上海苏净实业有限公司。1.2 实验方法 1.2.1 重楼皂苷的检测方法 1.2.1.1 重楼皂苷标准曲线的绘制 精密称取重楼皂苷标准品 5.0 mg，加甲醇溶解，定容至 25 mL，精密吸取皂苷标准溶液 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL 于 10 mL 具塞试管中，热风挥去甲醇，再加入 0.2 mL 新配制的 8%茴香 醛-乙醇溶液，摇匀，在冰浴下加硫酸 5 mL，摇匀，恒温水浴中加热 20 min 后立即在冰水浴中冷却 10 min，于 408nm 波长处测定吸光度，绘制标准曲线。1.2.1.2 重楼皂苷质量分数测定 取重楼皂苷提取物样品 5.0 mg，加甲醇溶解，定容至 25 mL。吸取 1.50 mL 溶液于 10 mL 具塞试管中，显色步骤同 1.2.1.1 项下方法，于 408 nm 测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算样品溶液中皂苷质量浓度。1.2.2 重楼总皂苷的提取工艺 将重楼干燥粉碎过 10 目（1.70 mm）筛，称取200 g过筛的重楼粉末用70%的乙醇以料液比110进行回流提取，提取时间为 90 min，回流提取两次，提取液 60 减压浓缩，加适量水呈混悬状，先用等体积石油醚脱脂，萃取 3 次，每次 30 min，保留水层；再用等体积水饱和乙酸乙酯萃取 3 次去除黄酮等中等极性小分子，每次 30 min，保留水层；最后用等体积水饱和正丁醇萃取 3 次，每次 30min，得到的正丁醇萃取液加入活性炭恒温脱色，过滤，80减压浓缩蒸干得到重楼总皂苷粗提物（C1）粉末，按照 1.2.1 重楼皂苷的检测方法操作，测定其总皂苷质量分数。1.2.3 重楼总皂苷的纯化工艺 1.2.3.1 大孔树脂预处理 先用 95%乙醇分别浸泡 5 种大孔吸附树脂 24 h，待其充分溶胀，然后用 95%乙醇洗涤至无浑浊。之后分别用5%的盐酸溶液和2%的氢氧化钠溶液各自浸泡树脂 3 h，最后用纯水洗至洗出液 pH 值为中性，备用。1.2.3.2 静态吸附与解吸附 选取 AB-8、D101、H103、SP825、HP-20 共 5 种大孔树脂对重楼总皂苷进行吸附解吸筛选试验。分别取 10 g 经过预处理后的 5 种大孔树脂装入锥形瓶中，接着取适量重楼总皂苷粗提物（C1）粉末用纯水溶解，配制成质量浓度为 0.175 mgmL-1的重楼粗总皂苷溶液（C1）。将重楼总皂苷粗提液（C1）100 mL 分别加到 5 种大孔树脂中，25 恒温振荡24 h。待树脂充分吸附粗提液后，过滤，测定滤液中重楼总皂苷的质量浓度，计算吸附量。将上述吸附饱和的大孔树脂装入 250 mL 锥形瓶中，各加入95%乙醇 100 mL，密封，25 恒温振荡 24 h，待充分解吸后，过滤，测定滤液的重楼总皂苷的质量浓度，计算解吸量。根据吸附量和解吸量选出最佳大孔吸附树脂。1.2.3.3 静态吸附动力学曲线 参考上述筛选的最佳树脂，称取 10 g 经过预处理的 SP825 型大孔吸附树脂装入 250 mL 的锥形瓶中，加入重楼粗总皂苷溶液（C1）100 mL，25 恒温水浴，160 次h-1振荡 3 h，每 30min 取一次上清液，按照 1.2.1 重楼皂苷的检测方法操作，在 408 nm 波长下测定其吸光度值并计算吸附率，绘制静态吸附动力学曲线。1.2.3.4 动态洗脱条件的优化 由于需要考虑的单因素实验次数太多，采用正交实验可以有效地选择部分有代表性的水平组合进行实验17，因此，重楼皂苷的动态洗脱条件主要考虑了乙醇洗脱体积分数（A）、上样量（B）和径高比（C）这 3 个因素，利用正交表对重楼粗总皂苷溶液（C1）进行吸附与解吸实验，正交实验设计表见表 1。第 52 卷第 2 期 余思宜，等：滇重楼中皂苷的精制及其抗炎功效验证 279 表 1 正交实验因素及水平 Table 1