癫痫清颗粒对阿尔茨海默病小鼠模型细胞焦亡影响_房小楠.pdf

20第25 卷 第 1 期 2023 年 1 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.1 Jan.，2023癫痫清颗粒对阿尔茨海默病小鼠模型细胞焦亡影响房小楠1，李昭2，贾冬3，董笑博1，明彩荣1，齐越3（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.沈阳医学院，辽宁 沈阳 110031；3.辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110034）基金项目：辽宁省科技厅项目（2019-ZD-0843）；沈阳市科技计划项目（19-112-4-072）作者简介：房小楠（1994-），女，辽宁大连人，硕士在读，研究方向：神经药理学。通讯作者：齐越（1977-），女，辽宁沈阳人，教授，博士，研究方向：神经药理学。E-mail：。摘要：目的 研究阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）模型小鼠神经细胞焦亡受癫痫清颗粒的作用效果。方法 先将小鼠随机分为假手术组、模型组、盐酸多奈哌齐组（1.3 mg/kg）、NLRP3炎症小体拮抗剂（MCC950）组、癫痫清颗粒组（12.48 g/kg）和MCC950+癫痫清颗粒组。除假手术组外，其余各组小鼠的左侧侧脑室内均注射淀粉样蛋白（A25-35）制作AD小鼠模型，癫痫清颗粒连续给药21 d，1次/d。第1621天，Morris水迷宫检测小鼠的空间学习和记忆能力，第22天各组小鼠取材，通过HE染色对神经元病理学变化进行观察，ELISA检测脑组织中白介素-1（interleukin-1，IL-1）、白介素-18（interleukin-18，IL-18）及肿瘤坏死因子-（TNF-）蛋白表达水平，免疫荧光检测脑组织中NLRP3蛋白表达水平，Western blot检测海马组织中NLRP3、IL-1、IL-18、TNF-、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）及半胱天冬氨酸酶（Caspase-1）蛋白表达水平。结果 与假手术组比较，模型组小鼠造模后游泳潜伏期显著增加，穿越平台次数大幅度减少，神经元胞体形状不规则，排列紊乱，间隙增宽，出现变性和坏死，NLRP3、IL-1、IL-18、ASC、TNF-及Caspase-1蛋白表达增加。与模型组相比较，各给药组通过训练后，游泳潜伏期明显缩短，穿越平台次数逐步增加；神经元细胞组织结构完整，排列紧密，间隙减小；NLRP3、IL-1、IL-18、ASC、TNF-及Caspase-1蛋白在组织中的表达水平均显著降低。结论 癫痫清颗粒通过抑制NLRP3的活化从而抑制神经焦亡的发生，同时使AD模型小鼠的学习和记忆能力得到改善。关键词：癫痫清颗粒；阿尔茨海默病；NLRP3炎症小体；细胞焦亡中图分类号：R285；R749.16 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)01-0020-06Effects of Dianxianqing Granules（癫痫清颗粒）on Pyroptosis in Alzheimers Disease Model MiceFANG Xiaonan1，LI Zhao2，JIA Dong3，DONG Xiaobo1，MING Cairong1，QI Yue3（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China；2.Shenyang Medical University，Shenyang 110031，Liaoning，China；3.The Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110034，Liaoning，China）Abstract：Objective To study the effect of Dianxianqing Granules（癫痫清颗粒）on neuronal pyroptosis in Alzheimers disease（AD）model mice.Methods Sham operation group underwent sham operation，and AD model was induced by intracerebroventricular（ICV）injection of-amyloid 25-35（A25-35），mice were randomly divided into sham operation group，model group，donepezil hydrochloride group（1.3 mg/kg），NLRP3 inflammasome antagonist（MCC950）injection group，Dianxianqing Granules group（12.48 g/kg）and MCC950+Dianxianqing Granules group.Administration groups were given relevant drug solution intrasgastrcially once a day，for consecutive 21 days.At last administration，the learning and memory ability was determined by morris water maze test，and HE staining was used to observe the pathological changes of neurons，and IL-1，IL-18 and TNF-expression in brain tissue were measured with enzyme linked immunosorbent assay.Immunofluorescence was used to detect the protein expression of NLRP3 in brain tissue.Western blotting assay was used to determine the protein expressions of NLRP3，IL-1，IL-18，TNF-，ASC and Caspase-1 in brain tissue.Results Compared with sham operation group，latency and protein expressions of NLRP3，IL-1，IL-18，ASC，TNF-and Caspase-1 in brain were increased significantly in model group；platform crossing times was decreased significantly，there were obvious pathological morphological changes such as irregular shape of neuron cell body，disordered arrangement，widening of gap，degeneration and necrosis in brain tissue.Compared with model group，latency and protein expressions of NLRP3，IL-1，IL-18，ASC，TNF-and Caspase-1 in brain were decreased significantly in Dianxianqing Granules，while the platform crossing times was increased significantly，pathological changes of brain tissue were improved to different extents in administration groups.Conclusion Dianxianqing Granules can further inhibit the occurrence of neuronal pyroptosis by inhibiting the activation of NLRP3，and improve the learning and memory ability of AD model mice.Keywords：Dianxianqing Granules（癫 痫 清 颗 粒）；Alzheimers disease；NLRP3 inflammasome；pyroptosis 阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）在老年痴呆中占比最高，是一种起病缓慢的中枢神经系统退行性病变，有3种主要病理特征，包含细胞外沉积的以淀粉样蛋白（amyloid，A）为核心的老年斑、tau蛋白高度磷酸化引起的神经元纤维缠结以及神经元大量损伤死亡。关于AD脑内神经细胞的死亡方式，目前研究多集中于脑细胞凋亡、坏死和自噬方面。焦亡作为体内一种炎症程序性细胞死亡方式，在AD研究中颇有价值1。作为脑内一种炎症形式的程序性细胞死亡，焦亡与炎症小体激活有关2，DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.01.00521 25 卷 辽宁中医药大学学报 激活的炎症小体可促进AD脑内炎症细胞因子的产生，造成神经细胞损伤，产生学习记忆障碍3。NOD样受体蛋白3（NLRP3）可引发神经元细胞焦亡4-5，抑制NLRP3，具有改善老年小鼠的神经元细胞焦亡、减轻神经功能障碍的作用6。因此，细胞焦亡的抑制可能是治疗AD的一种神经保护策略。癫痫清颗粒为名医史常勇的经方，由制首乌、水蛭、石菖蒲、白芍、郁金等常用中草药组成，具有补肝肾、通经络、祛痰湿等疗效。本课题组通过实验证明，癫痫清颗粒可以降低AD模型小鼠大脑中A沉积，保持神经元细胞功能正常和结构完整，提高小鼠学习和记忆能力7-9。目前，癫痫清颗粒是否与NLRP3介导的细胞焦亡相关，其具体机制及通路未能明确。故本研究选用A25-35诱导AD小鼠模型，观察癫痫清颗粒是否能作用于细胞焦亡的途径，是否会对NLRP3炎症小体的表达进行抑制，使炎症因子的产生量减少，从而抑制细胞焦亡，避免小鼠的学习和记忆能力的进一步退化。1材料1.1 动物120只SPF级ICR雄性小鼠，体质量（222）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司繁育，小鼠许可证号：SCXK（辽）2020-0001。1.2 药物和试剂 癫痫清颗粒（辽宁中医药大学附属第二医院，专利号：ZL201110069494，批号：20140110，1 g颗粒药含5.31 g生药）；A25-35（美国Sigma公司，货号：038M4822V）；盐酸多奈哌齐片（卫材药业有限公司，批号：140606A，5 mg/片）；MCC950（美国Selleck公司，货号：S8930）；NLRP3抗体（Proteintech公司，货号：00094786）；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）/辣根酶标记（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZB-2301）；CY3山 羊 抗 兔IgG（北 京 博 奥 森 生 物技术有限公司，批号：AD12101281）；白介素-1（IL-1）ELISA试剂盒（上海酶联有限公司，货号：00737775）；白介素-18（IL-18）ELISA试剂盒（上海酶联有限公司，货号：AC02061708）；小鼠/兔免疫组化试剂盒（博士德生物工程有限公司，货号：14I02I20G2320）。1.3 仪器小鼠脑立体定位仪（DW-200），购自成都泰盟科技有限公司；倒置荧光显微镜（DMI3000B），购自德国Leica公