紫芝基因组rDNA序列特征及ITS2二级结构比较_陈体强.pdf

Research paper 研究论文 22 January 2023,42(1):330-343 菌物学报 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Doi:10.13346/j.mycosystema.220423 资助项目：福建省农业科学院创新团队建设项目(CXTD2021014-2)；福建省公益类科研院所竞争性项目(2023R11030073)This work was supported by the Innovation Team Building Project of Fujian Academy of Agricultural Science(CXTD2021014-2)and the Competitive Projects of Fujian Public Welfare Research Institutes(2023R11030073).*Corresponding author.E-mail:chen_ Received:2022-10-20;Accepted:2022-11-01 菌物学报 Copyright 2023 Institute of Microbiology,CAS.All rights reserved.| Http:/journals- Tel:+86-10-64807521 330 陈体强 福建省农业科学院研究员，从事灵芝等福九味中药材研究与开发逾 30 年。近年来完成 4 种栽培灵芝的全基因组测序。紫芝基因组rDNA序列特征及ITS2二级结构比较 陈体强1*，徐晓兰2，石林春3，应正河1，钟礼义4 1 福建省农业科学院食用菌研究所，福建 福州 350014 2 福建农林大学动物科学院(蜂学院)中药资源与蜂产品系，福建 福州 350002 3 中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193 4 福建武平县食用菌技术推广服务站，福建 龙岩 364300 摘 要：紫芝栽培品种紫芝 S2(武芝 2 号)的 ITS 序列与 NCBI 数据库中 5 个紫芝菌株/分离株相似度高达 99.79%100%，在系统进化树上相聚成一类。本研究预测紫芝 S2基因组与参考基因组中的rRNA 基因簇，分析 rDNA 结构及各构件序列间的多态性。从高质量紫芝 S2基因组中挖掘得到完整 rDNA，序列全长 40.377 kb，由 4 组串联重复的(18S、5.8S、28S、5S)rRNA 基因簇组成，并含有完整的基因内间隔区(ITS1、ITS2)和基因间间隔区(IGS1、IGS2)。在紫芝 S2 的 rDNA 中，高度保守的 28S rRNA 基因间出现 3 个 SNP 和 2 个插入(1 bp，10 bp)位点；虽然第 4 条 ITS2 中有 1 个 SNP位点，但紫芝 S2 的 4 条 ITS2 在二级结构上的分子形态高度一致，与 ITS2 数据库中其他紫芝菌株仅存在螺旋区间夹角的微小差异。由紫芝 S2基因组 rDNA 的 ITS2 生成的 DNA 条形码与二维码，可以作为该栽培品种鉴定与同源物种其他菌株鉴别的分子标记。关键词：基因组；完整 rDNA；基因内间隔区；ITS2 二级结构；紫芝 引用本文 陈体强，徐晓兰，石林春，应正河，钟礼义，2023.紫芝基因组 rDNA 序列特征及 ITS2 二级结构比较.菌物学报，42(1):330-343Chen TQ,Xu XL,Shi LC,Ying ZH,Zhong LY,2023.Sequence characteristics of genomic rDNA and comparison of ITS2 secondary structure of Ganoderma sinense.Mycosystema,42(1):330-343 Research paper 22 January 2023,42(1):330-343 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 331Sequence characteristics of genomic rDNA and comparison of ITS2 secondary structure of Ganoderma sinense CHEN Tiqiang1*,XU Xiaolan2,SHI Linchun3,YING Zhenghe1,ZHONG Liyi4 1 Institute of Edible&Medicinal Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350014,Fujian,China 2 Department of Traditional Chinese Medicine Resources and Bee Products,College of Animal Science(College of Bee Science),Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,Fujian,China 3 Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100193,China 4 Fujian Wuping Mushroom Technical Advice Station,Longyan 364300,Fujian,China Abstract:The similarity level of ITS sequence of cultivar Ganoderma sp.Zizhi S2(Wuzhi No.2)was 99.79%to 100%to that of five known strains or voucher specimens of G.sinense registered in the NCBI database,and they were clustered together in the phylogenetic tree.In this study,the rRNA gene clusters in Zizhi S2 genome and the reference genomes were predicted,and the rDNA structure and the polymorphism of each component sequence were analyzed.A contiguous rDNA sequence with total length of 40.377 kb was extracted from the high-quality genome of Zizhi S2 for the first time,which was composed of four groups of tandem repeats(18S,5.8S,28S,5S)rRNA gene clusters,and also contained complete gene internal septal regions(ITS1,ITS2)and intergenic septal regions(IGS1,IGS2).There were three SNPs and two insertion(1 bp,10 bp)sites between the highly conserved 28S rRNA genes in the rDNA of Zizhi S2.There was also one SNP site in the fourth ITS2 region,but molecular morphology of the four ITS2 regions was highly consistent in secondary structure,and there was only a slight difference in the angle of helix interval with other strains of G.sinense in the ITS2 database.The DNA barcode and two-dimensional code generated by ITS2 of genomic rDNA of Zizhi S2,which reveal all information including ITS2 sequence and SNP site,can be used as molecular markers for identification of the cultivar and other strains of homologous species.Keywords:genome;contiguous ribosomal DNA;intragenic spaces;ITS2 secondary structure;Ganoderma sinense 自 JGI 1 000 个真菌基因组学计划启动以来(Grigoriev et al.2011,2014)，已完成 100 多个食药用菌基因组测序项目(刘淑艳等 2014；凌志琳和赵瑞琳 2018)，包括赤芝、紫芝、松杉灵芝和白肉灵芝等灵芝属物种的 13 个基因组(Jiang et al.2021；Liu et al.2021)，但未见报道存在于基 因 组 中 的 核 糖 体 DNA(ribosomal DNA,rDNA)完整序列。本研究之前在 NCBI 数据库中搜索，仅找到金针菇菌株 NJ6-3 的一组 rDNA 完整序列(GenBank 登录号：MH468771.1)，包括18S、5.8S、28S rRNA和ITS1、ITS2及5S和IGS1、IGS2 的完整序列(全长 10 471 bp)。已知真菌rDNA 的 内 转 录 间 隔 区(internal transcribed spacer,ITS)为中度保守区域，其保守性表现为种内趋异度小和种间趋异度较大(Wang&Yao 2005)；在进化上 ITS 比编码区快，这为灵芝属及其他真菌的研究提供丰富的遗传信息(林剑伟等 2007；黄晨阳等 2010)，基于种间特异性的分子标记可用于灵芝种类的鉴定(Park et al.2012)。在 GenBank 中注册的绝大多数 ITS 序列是采用 Sanger 法测序，通常包括 18S rRNA 基因的 3端部分序列，ITS1、5.8S rRNA 基因和 ITS2 陈体强 等/紫芝基因组rDNA序列特征及ITS2二级结构比较 研究论文 菌物学报 332 全部序列，以及 28S rRNA 基因的 5端部分序列。其中，ITS2 呈现更丰富的分子多样性，可以提供更多关于灵芝属种间和种内差异的序列信息(Wang&Yao 2005)；已知具有高度多样化群落的真菌，ITS2 序列区域受外界环境的影响较小，与编码区(18S 和 28S rRNA 基因)相比具有进化速度快的特点，是真核生物系统发育分析中一个成熟的分子标记(林剑伟等 2007)。随着基因组测序技术而发展起来的第三代分子标记，如单核苷酸多态性和一定数量的核苷酸插入或缺失而设计的 SNPs、InDel 分子标记(Bazzicalupo et al.2013；陈毅勇等 2017；徐伟南等 2018；沈秀芬等 2020)。Hebert et al.(2003)提出的 DNA 条形码(DNA barcodes)的概念，利用一段或几段标准的DNA 序列，像超市利用条形码来区分成千上万不同的商品一样，来达到快速、准确鉴定动物、植物和真菌物种的目的。Kress et al.(2005)提出选择作为 D