当归MADS-box生物信...学及SOC1克隆与表达分析_崔秀文.pdf

中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1551 当归 MADS-box 生物信息学及 SOC1 克隆与表达分析2 崔秀文1，刘 迪1，黄天苗1，李美玲1，栗孟飞1*，魏建和2*1.甘肃农业大学生命科学技术学院 干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730070 2.中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193 摘 要：目的 对当归Angelica sinensis MADS-box 基因家族进行筛选与生物信息学分析，并对SOC1-4 基因进行克隆与表达验证。方法 基于当归全长转录组筛选 MADS-box 基因家族，利用在线工具进行生物信息学分析，并利用qRT-PCR 检测SOC1-4 基因在不同材料中的表达水平。结果 当归全长转录组中含有29 个MADS-box 基因家族成员，可分为 10 个亚家族，共含有 6 个保守基序，蛋白质序列长度为49422 aa，相对分子质量为 5 697.5649 624.90，等电点为 5.0611.00，亚细胞结果显示当归 MADS-box基因家族成员分别定位于叶绿体、细胞核、细胞质和线粒体，二级结构预测及3D 建模显示同一亚家族结构相似；SOC1-4 基因克隆片段与全长转录组测序结果一致；SOC1-4 基因随种苗春化作用和植株发育时期延长呈现高表达，在抽薹植株、茎和叶中高表达，而在冷冻规避春化作用种苗中呈现低表达。结论 当归含有29个MADS-box成员，各成员理化性质和结构存在一定的差异，SOC1-4基因表达水平与当归抽薹开花生理调控一致，为当归 MADS-box 基因家族调控抽薹开花相关研究提供借鉴。关键词：当归；MADS-box；生物信息学；SOC1-4；基因克隆；抽薹开花 中图分类号：R286.12 文献标志码：A 文章编号：0253-2670(2023)05-1551-10 DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2023.05.022 Analysis on MADS-box bioinformatics,SOC1 clone and expression pattern in Angelica sinensis CUI Xiu-wen1,LIU Di1,HUANG Tian-miao1,LI Mei-ling1,LI Meng-fei1,WEI Jian-he2 1.State Key Laboratory of Aridland Crop Science,College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China 2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193,China Abstract:Objective To screen and analyze MADS-box gene family bioinformatics of Angelica sinensis,clone the SOC1-4 gene and perform bioinformatic analysis.Methods The MADS-box gene family was screened based on the full-length transcriptomes of A.sinensis,the bioinformatics was analyzed using the online tools,and the expression levels of SOC1-4 gene in different materials were validated by qRT-PCR.Results A total of 29 MADS-box gene family members were identified from A.sinensis,with 10 subfamily classified and six motifs included;the sequence length of MADS-box proteins ranged from 49 to 422 aa,the relative molecular mass ranges from 5 697.56 to 49 624.90,and the isoelectric point ranged from 5.06 to 11.00;the sub-cellular results showed that the members of the A.sinensis MADS-box gene family was located in the chloroplast,nucleus,cytoplasm and mitochondria;and secondary structure prediction and 3D modeling indicated that there was a similar structure for the same subfamily.The cloned fragment of the SOC1-4 gene was consistent with the full-length transcript.The SOC1-4 gene were over-expressed with the extension of seedlings vernalization and plants development,as well as in bolted plants,stems and leaves,respectively;while down-regulated in the seedlings with frozen-avoided vernalization.Conclusion There are 29 MADS-box gene family members in A.sinensis,and certain differences exist in physical and chemical properties and structure among the 29 members;the expression levels of SOC1-4 gene are in accordance with the physiological regulation of bolting and flowering of A.sinensis,The 收稿日期：2022-08-09 基金项目：国家自然科学基金项目（32160083）；干旱生境作物学国家重点实验室（甘肃农业大学）基金项目（GSCS-2021-Z03）；道地药材生态种植与质量保障项目（202103003）；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-21）作者简介：崔秀文（1996），女，甘肃靖远人，在读硕士研究生，主要从事当归抽薹开花调控方面研究。E-mail:*通信作者：栗孟飞（1980），男，河南驻马店人，博士，教授，主要从事药用植物学研究。E-mail: 魏建和（1970），男，福建建阳人，博士，教授，主要从事药用植物栽培、分子育种和次生代谢产物调控研究。E-mail: 1552 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 results will provide theoretical basis of MADS-box gene family for regulating bolting and flowering of A.sinensis.Key words:Angelica sinensis(Oliv.)Diels;MADS-box;bioinformatics;SOC1-4;gene clone;bolting and flowering 当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels 为伞形科多年生草本植物，干燥根是我国传统中药材，素有“十方九归”之称，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效1。现代药理学研究表明，当归根中的有机酸类、挥发油类和多糖类等化学成分在消炎、抗癌和治疗心脑血管疾病等方面具有显著效果2。目前，当归年需求量超 3 万 t，年种植面积达 4.35 万hm23-4。然而，当归在第 2 年肉质根成药过程中，出现高达 50%植株早薹开花的现象，导致肉质根木质化，药用有效成分含量降低且大量减产，药农经济收入减少，影响当归种质资源及产业发展5-8。MADS-box 基因家族是一类广泛存在于真核生物中的转录因子，在植物花器官分化、开花时间调节、以及果实发育等方面起到重要的调控作用9；其通常分为 I 型和 II 型，其中，II 型有 4个保守结构域：M-domain（MADS-domain）、I-domain（intervening domain）、K-domain（keratin-like domain）和 C-domain（C-terminal domain）10。目前，在模式植物拟南芥中发现了deficiens（DEF）、SQUAMOSA（SQUA）和TOMATO gene 3（TM3-like）等 12 个 MADS-box亚家族11。前期在当归转录组学的研究中发现，MADS-box 亚家族基因，如 SOC1（suppressor of overexpression of constans1）、FLC（flowering locus C）和 AGL26（agamouslike 26）等，在抽薹开花过程中差异表达12-16。研究证实，SOC1 基因是花器官分生组织形成过程中的关键基因，其通过整合外界环境和内在因素等各种成花途径信号，激活下游花器官发育所需的基因，如 LEAFY（LFY）、APETALA 1（AP1）和AGAMOUS（AG），进而促进植株开花17。前期当归研究中发现，SOC1 基因在完成春化作用的种苗根茎顶端分生组织以及早薹植株中高表达12-13，其上游基因如 COL16（constans-like）和下游基因（AGL62）在抽薹开花过程中也呈现高表达14。综合以上研究表明，尽管前人及本课题组已通过转录组测序获得了当归抽薹开花相关的MADS-box基因家族序列，并对关键基因（如 SOC1、AG 和 VRN1）的表达水平进行了 qRT-PCR 检测与分析12-16,18，然而，针对当归 MADS-box 基因家族以及关键基因SOC1 的生物信息学分析等方面的系统研究尚未有报道。因此，本研究基于前期当归全长转录组测序结果，开展了 MADS-box 基因家族生物信息学系统分析、SOC1-4 基因克隆及表达验证，旨在深入揭示MADS-box 基因家族的生物学功能，为有效抑制抽薹开花提供理论基础。1 材料与仪器 1.1 材料 当归 MADS-box 编码序列来源于：（1）不同品种（岷归 1 号和岷归 2 号）两年生大田植株叶片和叶柄的全长转录组，结果已提交 NCBI（Access：PRJNA782300），样品采集等详细信息见 Zhu 等18；（2）岷归 1 号种苗春化作用过程中T1（0、14 d；未通过春化）、T2（0、60 d；通过春化）和T3（3、125 d；低温规避春化）根茎顶端分生