丹蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大...RK通路关键蛋白表达的影响_汪四海.pdf

一种保护机制在哮喘寒饮蕴肺证中发挥的作用。同时，雷帕霉素组、小青龙汤组、温阳化饮方组大鼠肺组织中自噬基因和 信号通路的表达证明了雷帕霉素、小青龙汤、温阳化饮方对于支气管哮喘寒饮蕴肺证均有治疗作用，但温阳化饮方是减轻支气管哮喘寒饮蕴肺证气道炎症，支气管哮喘寒饮蕴肺证症状的最佳治疗方案。且本研究从分子水平上解释了温阳化饮方干预支气管哮喘寒饮蕴肺证气道炎症的作用机制，不仅为治疗支气管哮喘寒饮蕴肺证提供了新的思路，还为更好的研究疾病中自噬的作用机制，提供了一个重要的参考依据，为其开辟了新的研究平台。参考文献：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（）：吴加东，王爱飞，徐又佳，等 雷帕霉素药理作用的研究进展 医药导报，（）：，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（；）；国家中医临床研究基地业务建设第二批科研专项（）；国家重点研发计划“战略性国际科技创新合作”重点专项（）；国家重点研发计划“中医药现代化研究”重点专项（；）；安徽省高校自然科学研究重点项目（）；安徽省自然科学基金（）；安徽省高校协同创新项目（）；第五批省“特支计划”人才项目（“”）；安徽省中医药领军人才及培养对象项目（）；方朝晖安徽省名中医工作室（）；安徽中医药大学 年自然科学研究重点项目（）；年安徽省教学质量工程项目（）；年安徽中医药大学纵向探索性科研项目（）；年新安医学教育部重点实验室开放课题项目（）作者简介：汪四海（），男（汉族），安徽潜山人，安徽中医药大学讲师，主治医师，博士学位，主要从事中医药防治内分泌与代谢疾病工作通讯作者简介：方朝晖（），男（汉族），安徽宁国人，安徽中医药大学教授，主任医师，博士研究生导师，博士学位，主要从事中医药防治内分泌与代谢疾病工作丹蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏 水平和 通路关键蛋白表达的影响汪四海，方朝晖，唐阿飞，赵进东，马格非，储 俊，程若东，倪英群，王甜甜，熊国慧，方 舟，朱梦燕，毕 正，（安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥；安徽省中医药科学院中医药防治糖尿病研究所，安徽 合肥；新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥；安徽中医药大学，安徽 合肥；蚌埠市第三人民医院，安徽 蚌埠）摘要：目的 观察丹蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏 水平和内质网应激因子、及 表达的影响，探讨丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病的作用机制。方法 只雄性 大鼠随机选取 只作为空白（）组，其余大鼠采用高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素（）建立糖尿病肾病模型，最后 只大鼠造模成功，将其随机分为 组（奥美沙坦酯，）、组（丹蛭降糖胶囊，）、组（等容量蒸馏水），每组 只，组给予等量蒸馏水，干预 周后，麻醉状态下取材。取血清、尿液，检测大鼠肾功能、和 尿蛋白；采用 染色法观察肾脏组织病理学变化；采用 法检测肾脏组织、的含量，法检测肾脏组织、表达水平。结果 与 组比较，组 尿蛋白、的含量明显升高（）；与 组比较，组和 组 尿蛋白、的含量显著降低（），组的 显著降低（）；与 组比较，组 尿蛋白和 显著降低（）。与 组比较，光镜下 组和 组肾小球和肾小管结构和排列改善明显。组和 组、含量和、蛋白表达水平较 组显著下调（），其中 组较 组下调更显著（）。结论 丹蛭降糖胶囊能够显著减轻糖尿病肾病大鼠肾脏病变，改善肾功能，其机制可能与抑制 生成，降低、及 的表达有关。关键词：丹蛭降糖胶囊；糖尿病肾病；内质网应激；水平；通路 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）糖尿病肾病（，）是糖尿病（，）患者最常见的微血管并发症，其发病机制十分复 时珍国医国药 年第 卷第 期杂，也缺乏行之有效的治疗手段。糖基化终末产物（，）及其受体 介导的内质网应激（，）促进 的发生、发展，也是 的可能作用机制，当内质网过度应激时，肾脏组织 表达显著增加。丹蛭降糖胶囊（，）是我院方朝晖教授精心研制的治疗糖尿病及其并发症的有效院内制剂，经过长期的临床实践证明，能有效减轻早期 患者的临床症状，降低血糖和蛋白尿，改善肾功能。故本实验以肾脏 含量和内质网应激相关因子、的表达为切入点，探讨 治疗 的可能作用机制，为临床合理和规范用药提供进一步的依据。材料与仪器 动动物物 选取周龄为 周、体重（）的雄性 级 大鼠 只，购于安徽医科大学实验动物中心，许可证编号：（皖）。大鼠在安徽医科大学动物房饲养，保持温度（），相对湿度（），每天光照交替 小时。本实验经过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查批准。药药物物 丹蛭降糖胶囊，安徽中医药大学第一附属医院院内制剂（皖药制字，专利号 ），由太子参、牡丹皮、生地黄、泽泻、菟丝子、水蛭（配伍比例为：）组成，粒，批号；奥美沙坦酯片，北京富元医药股份有限公司，片，国药准字。试试剂剂与与仪仪器器 链脲佐菌素溶液（，美国 公司，货号）；兔抗鼠 抗体、兔抗鼠 抗体、兔抗鼠 抗体（英国 公司，货号分别为，）；和 试剂盒（美国 公司）；全自动生化分析仪（美国贝克曼公司）；多功能酶标仪（公司）；电热恒温箱（上海智城公司）；凯达 台式高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；低速离心机（盐城市安信实验仪器有限公司）；其林贝尔 水平摇床（浙江赛德仪器设备有限公司）；总蛋白裂解液（上海碧云天公司）；凝胶制备试剂盒、蛋白质浓度测定试剂盒（北京 公司）、化学发光检测试剂盒（美国 公司）；自动曝光仪（上海培清科技有限公司）。方法 大大鼠鼠分分组组、模模型型制制备备及及给给药药干干预预 将 只 大鼠适应性喂养 周，按照随机数字分组，取其中 只为空白组（），其余只大鼠按 体重单次腹腔注射 溶液联合高糖高脂饲料喂养，后，尾静脉法测随机血糖 者即糖尿病模型造模成功，根据文献方法，继续饲养 周，糖尿病大鼠肾脏组织即有早期病理改变，将造模成功的 只大鼠随机分为模型组（，）、奥美沙坦酯组（，）、丹蛭降糖胶囊组（，），每组 只。参照药理实验方法学中人与大鼠剂量换算方法，组和 组：按等体积蒸馏水灌胃；组给予奥美沙坦酯按（）剂量灌胃处理；组予以丹蛭降糖胶囊按成人 的等效剂量 （）灌胃处理，每组均干预 周。药物干预 周后用 戊巴比妥钠（）腹腔注射麻醉下取材。各各组组大大鼠鼠血血清清、尿尿液液、肾肾脏脏标标本本的的采采集集 末次给药后，用代谢笼收集大鼠 尿液，动物空腹状态下用 戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，剥离主动脉采血，取下肾脏用生理盐水进行清洗并称重，与 倍重量的磷酸盐缓冲液（，）充分匀浆。下，离心，收取上清液，收取的上清液及剩余的肾脏在 冰箱保存，待进行相关指标检测。各各组组大大鼠鼠肾肾功功能能、和和 尿尿蛋蛋白白检检测测 采用生化法检测各组大鼠血清、和 尿蛋白含量。各各组组大大鼠鼠肾肾脏脏组组织织形形态态学学观观察察 采用 染色法观察肾小球结构和肾小管排列顺序，取右侧肾脏组织，于 中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋切片（厚度为），伊红 苏木素复染，梯度脱水后二甲苯通透，中性树脂胶封片，光学显微镜下观察肾脏组织的形态变化。各各组组大大鼠鼠肾肾脏脏组组织织 、检检测测 严格根据 试剂盒厂家说明书，用分光光度计法测定收集的匀浆上清中、含量。各各组组大大鼠鼠肾肾脏脏组组织织 、和和 的的蛋蛋白白表表达达 采用蛋白质免疫印迹法检测蛋白表达水平，每组取肾脏组织，加入 细胞裂解液（每 包含 蛋白酶抑制剂），离心后提取蛋白，检测蛋白浓度，保证每个样品总蛋白量。每个样品总蛋白上样量均为，进行制胶与上样，按浓缩胶、分离胶 进行恒压电泳，按 恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整，将转好的膜加入封闭液室温封闭，加入已稀释好的一抗 过夜（兔属，与脱脂牛奶呈：，与 脱脂牛奶呈：，与 脱脂牛奶呈：）用 洗 次，每次，加入稀释好的二抗（与 脱脂牛奶呈：），室温孵育，用 在室温摇床上洗 次，每次，暗室中曝光，将胶片进行扫描存档，最后用 自动曝光仪来检测、和 的蛋白表达情况。结果 各各组组大大鼠鼠一一般般情情况况 实验过程中，空白组大鼠精神状态良好，毛发光泽，动作敏捷，进食饮水正常，体重持续增加，二便正常。腹腔注射 后造模成功的大鼠出现了多食、多尿、多饮，精神萎靡，活动量下降，反应迟钝，毛发晦暗。给药 周后，组和 组大鼠较模型组大鼠均有一定程度好转，尤其是 组大鼠精神状态明显好转。在实验期间，只造模成功的 大鼠，空白组大鼠由于相互打斗撕咬死亡 只，模型组大鼠可能由于短时间内血糖升高过快或者发生酮症酸中毒死亡 只，奥美沙坦酯组由于灌胃操作不当致大鼠死亡 只。最终实验结束时，空白组大鼠 只，模型组大鼠 只，奥美沙坦酯组大鼠 只，组 只。各各组组大大鼠鼠 染染色色观观察察肾肾组组织织形形态态变变化化 染色下，组肾小球结构和形态正常，肾小管排列整齐，未出现肾小管损伤，肾间质无增宽，未出现明显病理改变；组肾小球结构紊乱，发生空泡样变化，基底膜增厚，肾小管排列杂乱，损伤明显，间质增宽，出现不同程度的水肿，并出现大量纤维组织增生和炎性细胞；组和 组与 组比较，肾小球结构较清晰，空泡样变化减轻，肾小管排序基本正常，肾间质病变减轻和有少量的纤维组织增生；组和 组比较，肾小球结构、形态，肾小管排列和间质损伤、纤维化情况均改善明显。见图。：空白组；：模型组；：奥美沙坦酯组；：丹蛭降糖胶囊组图 染色观察各组大鼠肾组织形态变化（染色，）时珍国医国药 年第 卷第 期 各各组组大大鼠鼠空空腹腹血血糖糖变变化化 治疗前，与 组比较，组大鼠 显著升高（），各治疗组与 组比较具有可比性（）。给药 周后，与 组比较，组大鼠 升高（）；与 组比较，组 降低，差异有统计学意义（），组 无明显降低（）；与 组比较，组 降低（）。见表。表 各组大鼠空腹血糖变化（?）组别血糖 治疗前治疗后 组 组 组 组 与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，各各组组大大鼠鼠血血清清肾肾功功能能和和 尿尿蛋蛋白白含含量量变变化化 与 组比较，组大鼠血清、尿蛋白含量显著增高（）；与 组比较，组和 组血清 和 尿蛋白含量显著降低（）；与 组比较，组 尿蛋白含量显著下降（），而血清 的含量变化不显著，差异无统计学意义（）；各组大鼠间 含量变化不显著，差异无统计学意义（）。见表。表 各组大鼠血清肾功能和 尿蛋白含量变化（?）组别 尿蛋白 组 组 组 组 与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，各各组组大大鼠鼠肾肾脏脏组组织织 、含含量量 与 组比较，组大鼠肾脏、含量显著升高（）；与 组比较，组和 组大鼠肾脏、含量显著下降（），其中 组大鼠肾脏、含量较 组下降更显著（）。见表。表 各组大鼠肾脏组织、含量变化（?）组别 组 组 组 组 与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，各各组组大大鼠鼠肾肾脏脏组组织织 、和和 蛋蛋白白表表达达 与 组比较，组的、和 蛋白表达水平显著上调（）；组与 组的、和 蛋白表达水平较 组均显著下调（），与 组比较，组、和 蛋白表达水平下调显著（）。见表，图。表 各组大鼠肾脏组织、和 蛋白表达水平（?）组别 组 组 组 组 与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，讨论 是糖尿病常见的并发症，严重危害着人类的身心健康，已成为近年来国内外研究的热点与难点，西医对其治疗不外乎控制血糖、血压、血脂，改善循环等综合处理，不良反应较多，远期疗效不尽如人意，中医药在治疗 方面具有“整体调节、增效减毒、扶正祛邪、标本兼治”的优势，。归属于中医“下消”“肾消”范畴，其病机的关键是“气阴两虚，肾络瘀阻”，治宜益气养阴，活血通络。丹蛭降糖胶囊是由太子参、生地黄、牡丹皮、菟丝子、泽泻、水蛭六味药组成的中药复方制剂，全方通补兼施，寒温并用，脾肾同治，扶正与驱邪并举，共奏补气滋阴，活血通络之功，切中 的基本病机。图 各组大鼠肾脏组织、和 蛋白表达水平 的发病机制十分复杂，但是目前可以明确的是，长期的高糖环境容易导致肾脏 的生成增多，从而介导肾脏组织的 被激活，随即启动 信号通路，引起患者肾脏组织的细胞凋亡，继而出现肾功能显著损伤。大量研究表明，是 中重要的分子伴侣，也是 发生和存在的标志蛋白，它的高低在一定程度上反映了 的水平，。等发现，激活 大鼠足细胞 后，可明显促进 的表达，进而诱导 发生，通过一系列反应