丹参粉HPLC指纹图谱的建立及化学计量学方法评价_朱志坤.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 857 丹参粉HPLC指纹图谱的建立及化学计量学 方法评价朱志坤1，郭媛媛1，王飘1，杨唯1，邱斌1，杨云2，陈凌云1（1云南中医药大学中药学院，昆明 650500；2云南向辉药业有限公司，昆明 650500）摘要：目的：建立丹参粉高效液相（HPLC）指纹图谱，并结合多成分定量及化学计量学方法，对不同厂家丹参粉进行含量测定及质量评价。方法：采用HPLC法检测，色谱条件DiKMA C18色谱柱（4.6 mm250 mm，5 m），乙腈-0.02%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长275 nm。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”计算相似度，SPSS 26.0进行系统聚类分析（HCA），SIMCA 14.1进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。结果：共13个共有峰，相似度均在0.95以上，通过与对照品对比，共指认出4个成分：丹酚酸B（2号峰）、隐丹参酮（10号峰）、丹参酮（11号峰）、丹参酮A（13号峰）；HCA及PCA结果显示，当平方欧氏距离为15时，23批样品可以聚为3类，S9单独为一类，S1、S4S5聚为一类，S2S3、S6S8、S10S23聚为一类；隐丹参酮对于样品在主成分1区分上荷载值较大，丹酚酸B对于样品在主成分2区分上荷载值较大；PLS-DA结果显示，4个成分中，丹酚酸B的VIP值1.0。结论：建立丹参粉HPLC指纹图谱测定方法准确灵敏，稳定性和重复性好，化学计量法能够较好地辨识影响丹参粉质量的标志性成分，为丹参粉的质量研究提供参考。关键词：丹参粉；指纹图谱；聚类分析；主成分分析；偏最小二乘分判别分析；质量评价基金资助：云南省技术创新人才培养计划项目（No.2018HB088）Establishment of HPLC fingerprint of Salvia miltiorrhiza powder and evaluation of chemometricsZHU Zhi-kun1,GUO Yuan-yuan1,WANG Piao1,YANG Wei1,QIU Bin1,YANG Yun2,CHEN Ling-yun1(1College of Traditional Chinese Medicine,Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2Yunnan Xianghui Pharmaceutical Co.Ltd,Kunming 650500,China)Abstract:Objective:The HPLC fingerprint of Salvia miltiorrhiza powder was established,and the content determination and quality evaluation of Salvia miltiorrhiza powder from different manufacturers were carried out with multi-component quantitative and stoichiometry methods.Methods:HPLC method was adopted,the determination was performed on DiKMA C18 column(4.6 mm250 mm,5 m)with acetonitrile-0.02%phosphoric acid solution(gradient elution)as mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min.The detection wavelength was 275 nm.The similarity was evaluated by the Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System(2012 version),hierarchical clustering analysis(HCA)was performed by SPSS 26.0,principal component analysis(PCA)and partial least squares discrimination analysis (PLS-DA)were performed by SIMCA 14.1.Results:There were 13 common peaks in HPLC fingerprints,the similarity was above 0.95,by comparison with the standard,four peaks were identified,salvianolic acid B(peak 2),cryptotanshinone(peak 10),tanshinone(peak 11),and tanshinone A(peak 13).The results of HCA and PCA showed that when the square Euclidean distance was 15,23 batches of samples could be clustered into three categories,S9 alone was one category,S1,S4S5 were clustered into one category,S2S3,S6S8,S10S23 were clustered into the other category.Loading score of PC1 was higher for cryptotanshinone,while loading score of salvianolic acid B was higher for PC2.PLS-DA analysis showed that 研究报告通信作者：陈凌云，云南省昆明市呈贡区雨花路1076号云南中医药大学中药学院，邮编：650500，电话：0871-65918101E-mail：内文2.indd 8572023/2/28 10:36:38中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 858 the VIP value of salvianolic acid B was greater than 1.0.Conclusion:The established fingerprint method for the determination of Salvia miltiorrhiza powder is accurate,sensitive,stable and reproducible,and chemometrics is good enough to identify the landmark components affecting the quality of Salvia miltiorrhiza powder,which provides reference for the quality research of Salvia miltiorrhiza powder.Key words:Salvia miltiorrhiza powder;Fingerprint;Hierarchical clustering analysis(HCA);Principal component analysis(PCA);Partial least squares discriminant analysis(PLS-DA);Quality evaluationFunding:Yunnan Province Technological Innovation Talent Training Program Project(No.2018HB088)丹参粉为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎经打粉制得，性苦，微寒，归心、肝经，具有活血化瘀、通经止痛、凉血消痈等功效，可用于治疗胸痹心痛、脘腹肋痛、癥瘕积聚、热痹疼痛、疮疡肿痛等1。现代研究2表明，丹参中主要活性成分为脂溶性成分和水溶性成分，其中脂溶性成分主要包括丹参酮类成分，水溶性成分主要包括丹酚酸类成分。具有抗炎、降血糖、抗肿瘤、抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化等功效3-7。目前，2020年版中华人民共和国药典（以下简称药典）丹参项下，仅有丹参饮片及酒丹参，并未对丹参粉质量标准作出规定，其他丹参粉相关标准，包括注射用丹参（冻干）、丹参粉针剂，也并未涉及直接口服丹参粉饮片。本研究采用HPLC法对不同厂家、不同批号丹参粉进行指纹图谱研究，以2020年版 药典丹参项下规定的4种成分含量测定，并采用化学计量学方法分析不同厂家的丹参粉差异，为丹参粉质量标准提升提供依据。材料1.药物与试剂 丹参粉来源信息详见表1。丹酚酸B（批号：111562-201917，纯度：96.6%）、隐丹参酮（批号：110852-201807，纯度：99.0%）、丹参酮（批号：110867-201607，纯度：99.1%）、丹参酮A（批号：110766-202022，纯度：98.9%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（色谱纯，美国SIGMA-ALDRICH公司）；磷酸（分析纯）；水为娃哈哈纯净水。2.仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；奥豪斯万分之一天平奥豪斯仪器（常州）有限公司；AB265-S分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SK2200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。方法与结果1.色谱条件 DiKMA C18色谱柱（4.6 mm250 mm，5 m），流动相为乙腈（A）-0.02%磷酸（B），梯度洗脱：015 min，20%26%A；1522 min，26%40%A；22 29 min，40%47%A；2949 min，47%63%A；4957 min，63%69%A；5772 min，69%90%A；7285 min，90%A；检测波长275 nm；流速1.0 mL/min；柱温20；进样量10 L。2 溶液的制备2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮A适量至5 mL容量瓶中，以80%甲醇溶解并定容至刻度线，制得含有丹酚酸B 0.9560 mg/mL、隐丹参酮0.1040 mg/mL、丹参酮 0.1000 mg/mL和丹参酮A 0.9560 mg/mL混合对照品储备液。2.2 供试品溶液的制备 取丹参粉0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称重，超声处理30 min，放冷，称重，80%甲醇补足减失的重量，以0.45 m有机滤头滤过，取续滤液，即得。表1 23批样品来源编号批号生产厂家产地分组S120091911云南华优中药科技有限公司山东日照AS220092011云南华优中药科技有限公司山东日照AS321030211云南华优中药科技有限公司山东日照AS420201201德宏久丽康源生物科技开发 有限公司安徽亳州BS520201202德宏久丽康源生物科技开发 有限公司安徽亳州BS6200237云南兰茂药业有限公司四川德阳CS7200268云南兰茂药业有限公司四川德阳CS8210008云南兰茂药业有限公司四川德阳CS92004003云南七丹药业股份有限公司山东日照DS102010004云南七丹药业股份有限公司山东日照DS112011013云