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麦冬多糖对大鼠急性心肌损伤和人脐静脉内皮细胞过氧化的影响 孙丽妹，陈 庆，於景琪，陈 扬，潘莉莎，修雯婧 [摘要] 目的 研究麦冬多糖对急性心肌缺血和人脐静脉内皮细胞过氧化的影响。方法 将SD大鼠分为 5组：正常组、模型组、OJP1-100组、OJP1-300组、阳性组。应用药物灌胃法制备ISO诱导的急性心肌损伤大鼠模型，光、电镜观察心肌受损情况，心肌中MDA、SOD试剂盒进行各物质含量测定，ET-1、NOS荧光定量PCR进行表达情况的分析，大鼠血清NO、IMA含量的测定，心电图、心肌酶谱的检测。H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型建立，MTT法检测HUVEC细胞增殖，细胞内SOD、NO、MDA含量的检测，流式细胞仪检测细胞内ROS及细胞凋亡。 结论 麦冬多糖可一定程度的减少急性心肌缺血导致的心肌损伤，对细胞的氧化损伤有一定的保护作用。 [关键词] 麦冬多糖；急性心肌缺血；细胞氧化损伤 麦冬又名沿阶草、书带草、麦门冬，为百合科沿阶草属多年生常绿草本植物。研究证明，麦冬多糖在抗心肌缺血、氧化损伤等方面具有重要的药理作用。本实验分别以ISO 诱导的急性心肌损伤大鼠和H2O2诱导的氧化损伤人脐静脉内皮细胞作为研究对象，以麦冬多糖作为研究目标，对麦冬多糖进行生物体外(in vitro)和生物体内(in vivo)的药理作用研究。 1 材料和方法 1.1 材料 人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）由本实验室保存； SD雄性大鼠30只，体重200g±20g。 主要试剂与仪器：麦冬多糖由本实验室提取；1640培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、异丙肾上腺素（ISO）购自sigma公司；青霉素-链霉素溶液（100X）、胰酶细胞消化液、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、一氧化氮（NO）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒和活性氧（ROS）试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；逆转录试剂盒购自大连宝生物；其余试剂均为国产分析纯。 二氧化碳培养箱3111：美国Thermo公司；低温离心机：德国Eppendorf 公司； Varioskan Flash 多功能酶标仪：Thermo scientific；倒置相差显微镜：Nikon eclipse 50i 812187；流式细胞仪：FACS Arial，美国BD公司；722分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；透射电子显微镜：日本HEMiC公司。 1.2 方法 ①分组： 大鼠随机分为5组，每组6只，雌雄各半，分笼饲养：正常对照组、ISO模型对照组、麦冬多糖给药组（OJP1-100、OJP1-300）、普萘洛尔组（Inderal-10）。每组6只。正常对照组与模型对照组大鼠每日给予以等量生理盐水（2 mL）灌胃，其他灌胃药物均用等量的生理盐水配制。低麦冬多糖组（OJP1-100）每日按100 mg/kg体重灌胃给药，高麦冬多糖组（OJP1-300）每日按300 mg/kg体重灌胃给药，普萘洛尔组（Inderalt-10）每日按10 mg/kg体重灌胃给药。于灌胃的第13天、14天灌胃30 min后按ISO 4 mg/kg的剂量进行腹腔注射，正常对照组给予等量的生理盐水进行腹腔注射。所有组大鼠于第15天（末次腹腔注射ISO 后24小时）Medlab监测心电图变化后一次性处死。 取对数生长期的HUVEC细胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化，轻轻吹打制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种到6孔板中，待细胞铺满70%-80%，更换无血清的1640培养液，然后分别加入麦冬多糖使其终浓度分别为25 μg/mL、50 μg/mL、100μg/mL、200 μg/mL，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养。 ②动物方法 1.2.2 动物标本的采集及处理 1.2.3 心指数计算 1.2.4心肌酶谱四项测定 1.2.5 酶联免疫吸附测定法测定血清NO、ET-1及IMA的含量 1.2.6 心肌病理形态学观察 1.2.7 心肌透射电镜超微结构观察 1.2.8 荧光定量PCR检测心肌组织eNOS、ET-1基因表达 1.2.9 SOD活力、CAT活力及MDA含量测定 1.2.10统计学处理 1.3 细胞方法 1.3.1 MTT法检测HUVEC细胞增殖 1.3.2 细胞内SOD与MDA的检测 1.3.3 细胞内NO的检测 1.3.4 流式细胞仪检测细胞内ROS 1.3.5 Annexin V-FITC细胞凋亡检测 2 结果 1 大鼠 1.1 大鼠心指数及心肌酶谱 与正常组相比，模型组大鼠心指数高且有显著性差异；与模型组相比，OPJ1-100组、普萘洛尔组心指数低且均有显著性差异，而OPJ1-300心指数无显著性差异；与正常组相比，模型组大鼠心肌酶谱四项的指标均显著升高，与模型组相比，低、高剂量麦冬多糖给药组及阳性药物普萘洛尔组的四项指标都有不同程度的降低。 1.2 大鼠血清内皮素（ET-1) 与正常组相比，模型组大鼠血清内皮素（ET-1）升高，有显著性差异；与模型组相比，OJP1-100组、OJP1-300组和普萘洛尔组血清ET-1均降低有显著性差异。 1.3 大鼠血清NO 与正常组相比，模型组大鼠血清NO浓度下降，统计学分析有极显著性差异； 与模型组相比，OPJ1-100组和普萘洛尔组血清NO浓度升高，统计学分析有显著性差异；OPJ1-300组血清NO浓度无显著性差异 1.4 大鼠血清IMA 与正常组相比，模型组大鼠血清IMA升高，有显著性差异；与模型组相比，OJP1-100组、OJP1-300组大鼠血清IMA下降，均有显著性差异，普萘洛尔组血清IMA无显著性差异。 1.5 大鼠心肌组织SOD活力 与对照组比较，模型组SOD活力降低；经药物治疗后，OJP1-100、OJP1-300组及普萘洛尔组的SOD活力较模型组增高，但统计学分析均无显著性差异 1.6大鼠心肌MDA含量 与正常组相比，模型组大鼠MDA含量升高，有显著性差异；与模型组相比，OJP1-300组、OJP1-100及普萘洛尔组MDA含量均降低，都有显著性差异 1.7大鼠心电图组相比，模型组大鼠心电图ST段偏移有极显著性差异。低、高剂量麦冬多糖给药组ST段偏移分别为：0.026±0.005，0.018±0.0 与正常05，与模型组比较，ST段上移幅度差异有显著性意义而与正常组比较，ST段上移幅度无显著性差异，同时不同浓度的麦冬多糖给药组ST段偏移值存在一定差异同时，低浓度麦冬多糖对抗ST段偏移，改善心电图变化的效果较高浓度麦冬多糖及阳性药物普萘洛尔好 2 细胞 2.1 结论与讨论 通过对大鼠进行麦冬多糖、生理盐水及普洛萘尔药物灌胃饲养，并于处死前进行ISO腹腔注射来建立ISO诱导大鼠心肌损伤模型。结果发现：模型组大鼠心指数显著升高，心肌酶谱四项的指标均显著升高，说明ISO造成心肌组织肿大、破裂；其血清内皮素（ET-1）也显著升高，NO含量显著降低，IMA含量显著升高，表明心肌损伤，心肌供血不足，血压升高；且SOD含量显著降低，MDA含量显著升高，表明其清除自由基能力显著下降，受到氧化损伤多；心电图而言，S-T段显著升高，甚至有T波倒置，出现急性心肌梗塞。 低浓度给药组和普洛萘尔组心指数较模型组有显著差异，但高浓度组却不存在显著性差异，说明麦冬多糖对心肌水肿有治疗效果，且100mg/kg的麦冬多糖给药效果好于300mg/kg，具有量效依赖性；心肌四项酶谱指标中高、低给药组及阳性组较模型组虽有降低，但降低的程度不存在剂量依赖趋势，所以麦冬多糖在心肌细胞细胞膜通透性改变或破裂方面作用不显著。 低、高浓度给药组及阳性组血清ET-1含量就模型组而言均有显著性降低，表明麦冬多糖可以降低大鼠血清ET-1含量，其中100mg/kg的作用效果好于300mg/kg及普洛萘尔组，说明麦冬多糖对大鼠血清内皮素（ET-1）含量的影响存在剂量依赖趋势；低浓度给药组及阳性组NO含量就模型组比较有显著性升高，IMA含量就模型组而言有显著性下降，效果均好于高浓度组，表明麦冬多糖在100mg/kg的浓度治疗效果较好。 麦冬多糖对大鼠心肌MDA含量的作用中，300mg/kg的作用效果好于100mg/kg，说明在脂质过氧化程度方面，心肌损伤对麦冬多糖仍具有量效依赖性。从HE染色切片及透射电镜观察可看出麦冬多糖对心肌损伤有治疗作用，对心肌的形态损伤有一定的修复作用。