内支架法自体组织修补胆管缺损的体外和动物实验研究.pdf

浙江大学博士学位论文内支架法自体组织修补胆管缺损的体外和动物实验研究姓名：俞一尘申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：蔡秀军201104浙江大学博士学位论文中文摘要内支架法自体组织修补胆管缺损的体外和动物实验研究第一部分浙江大学医学院外科学(普外科)博士研究生俞一尘导师蔡秀军教授中文摘要模拟内支架环境下成纤维细胞增殖的体外实验研究研究目的在体外模拟内支架自体材料胆道吻合的胆道环境，观察作为胆道瘢痕修复重要元素的成纤维细胞的增殖情况。研究方法利用体外培养的成纤维细胞，模拟体内的胆汁环境，利用显微镜观察、M T T 法测量不同环境下成纤维细胞的增殖和双标记流式细胞术分析其成纤维细胞凋亡率来研究胆管瘢痕愈合过程中胆汁的作用。实验组胆汁环境用加入1 的胆汁建立，对照组加入等量培养液结果显微镜观察胆汁环境培养4 8 小时后实验组成纤维细胞的增殖多于对照组；胆汁培养4 8 小时及7 2 小时后不同浓度的成纤维细胞的O D 5 7 0 值较对照组升高均具有统计学差异(P 0 0 5)；双标记流式细胞术检测在胆汁环境中培养的成纤维细胞凋亡率较对照组低，比较可见具统计学意义(P o 0 5)结论胆汁环境中可以促进成纤维细胞的增殖并向肌成纤维细胞转化，胆汁抑制了成纤维细胞的凋亡。浙江大学博士学位论文中文摘要可以认为内支架胆道对端吻合的术式隔绝了胆汁环境对吻合口的刺激和影响，在一定程度上降低了因胆汁刺激引起的成纤维细胞增殖和向肌成纤维细胞转化导致的胆道瘢痕过度愈合，为下一步的动物实验提供了理论依据。【关键词】胆汁；成纤维细胞；凋亡第二部分内支架法自体组织修补胆管缺损的动物实验研究研究目的通过动物实验验证内支架法自体组织修补胆管缺损的可行性和安全性。研究方法利用已有的可降解胆道支架，选取巴马小型猪为实验对象，随机分为两组，每组1 5 头。动物手术构建胆总管缺损的模型，实验组采用内支架法自体组织修补胆管缺损：将设计的可降解支架与胆管两端捆绑连接，支架中部保留1 0 c m的胆管缺损并用自体大网膜修补；对照组采用胆管对端吻合术。术后观察实验动物黄疸和胆漏情况；术后2 周，1 月，3 月每个实验组各处死5 头实验动物，分别比较实验动物自身术前和术后2 周，1 月，3 月炎症指标(C B C，C I 冲)、肝酶(脚、A S T、A L P)和血总胆红素的变化；观察两实验组大体标本、肝脏组织病理切片H E 染色、吻合口病理形态学改变：包括脏染色、M a S s o n 染色和0【s M A、T G F p 1、b F G F 免疫组化染色；术后1 月及3 月两实验组随机抽取实验动物行胆道造影；测定术后2 周，1 月，3 月时吻合口的羟脯氨酸含量；利用相对定量I m P C R 检测术后2 周，1 月，3 月时吻合口a S M A、T G F p 1 b F G Fm R N A 的表达情况。结果两实验组均顺利完成手术，术后无黄疸及胆漏发生。两实验组炎症指标(C B C、C I 强)的检测中，除对照组术后2 周及3 月白细胞计数升高具统计学意义(P O 0 5)外，其余结果无显著差异；肝功能及总胆红素检测提示除对照组术后3月削一T、A S T、A L P 升高较术前具统计学意义(P o 0 5)，实验组术后3 月、对照H l浙江大学博士学位论文中文摘要组术后1 月、3 月总胆红素升高较术前具统计学意义(P O 0 5)。实验组术后2 周及1 月可及手术用可降解支架在位，吻合口局部轻度水肿充血，术后3 月支架已降解消失，吻合口充血水肿已基本消退。对照组术后2 周及1月吻合口局部轻度水肿充血，术后3 月可见近端胆管轻度扩张，吻合口略狭窄。实验组动物术后1 月及3 月胆道造影提示：吻合处无造影剂渗漏，肝内胆管显影未见扩张，胆总管引流通畅，十二指肠显影佳。对照组可见胆管下段通畅，十二指肠显影良好，但部分实验动物(术后1 月组：1 头5 头，术后3 月组：1 头5 头)肝内外胆管有不同程度的扩张。H E 染色结果见术后2 周可见吻合口水肿伴较多炎症细胞浸润，以巨噬细胞及淋巴细胞为主，粘膜下固有层胶原纤维增生，可见小血管增生，实验组较对照组增生的胶原较少；术后1 月可见吻合口水肿己消退，炎性浸润较前有减轻，粘膜下胶原增生明显伴有纤维化，纤维结构紊乱，新生胆管上皮生长伴有腺体增生，实验组较对照组粘膜下纤维化和血管增生情况轻；术后3 月可见吻合口新生胆管上皮生长，粘膜下胶原增厚明显伴有纤维化，但纤维结构紊乱情况较1 月时好转，腺体增生减少，实验组较对照组胶原增生情况轻。术后各时间点肝脏脏染色均未见明显淤胆情况发现。M a L s s o n 染色见术后1 月胶原纤维增生伴有纤维化，排列较为紊乱，实验组较对照组胶原增生程度轻，排列相对有序；术后3 月胶原纤维增生伴有纤维化明显，排列紊乱情况较前好转，实验组较对照组胶原增生程度轻，排列相对有序。a S M A 免疫组化阳性评分术后1 月及3 月两组间有统计学差异(P 0 0 5)，评分随时间推移有增高趋势，T G F p 1 免疫组化阳性评分术后2 周时两组间有统计学差异(P o 0 5)，评分随时间推移有下降趋势，b F G F 免疫组化阳性评分术后1 月时两组间有统计学差异(P O 0 5)，术后1 月和3 月时实验组和对照组间比较具统计学差异(P 0 0 5)。T V浙江大学博士学位论文中文摘要I m P C R 结果显示术后2 周时实验组较对照组b F G F、T G F p 1m R N A 表达增加，0【S M A m R N A 表达减少；术后1 月时实验组较对照组b F G Fm R N A 表达增加，T G F p 1、0【S M A m I 矾A 表达减少；术后3 月时实验组较对照组b F G F、T G F D 1m R N A 表达相似，0【S M Ar I 斟A 表达减少。结论利用大网膜作自体材料的内支架法胆道对端吻合术是一种操作简单，安全可行的胆道重建方式。动物实验研究显示利用大网膜作自体材料的内支架法胆道对端吻合术较直接的胆道对端吻合术在近期预防胆道瘢痕过度愈合上具有优势，操作简单可行，但支架的降解周期可能需适当延长，仍需大样本远期动物实验和临床研究论证完善。【关键词】可降解支架；自体组织；胆管缺损V浙江大学博士学位论文英文摘要I nV i t r oa n da n i m a ls t u d i e so fi n t r a l u m i n a ls t e n tr e p a i ro fb i l ed u c td e f e c tw i t ha u t o l o g o u st：i s s u eC o l l e g e0 fM e d i c i n e，Z h e j i a l l g 嘣V e r s 毋S W g e r y(G e n e r a Js 吨q)D o c t o m lC a I l d i d a t eY u c h e nS u p e r v i s o rP r o C a jX i u-j u I lP a nIA b s t r a c tI nV i t r os t u d yo ff i b r o b l a s tp r o I i 五e r a t i o ni ns i m u l a n tb i l i a r ye n V i r o n m e n to b j e c t i v eT 0o b s e r V e 也ep r o l i f e r a t i o no ff i b r o b l a S tV 以1 i c hi so n eo ft l l em o S ti m p o r t a n tp 叭so fb i l ed u c tr e p a i rb ys i I I l u l a t i n gn l eb i l i a 巧e n V i r o 啪e n t 觞廿l ei 1 1 廿a l 删I l a ls t e n ta n a s t o m o s i so fb i l ed u c td e f e c tw i ma l J t D l o g o u st i s s u ei 1 1v i t r o M e t h o d sS i I I l u l a t 啦t h eb i l i a D，e n V i r o I l n l e mb y 纳r o b l a s tc u l t u r e di I lV i 仃o，a n ds m d y i n gt l l e 丘m c t i o no fb i l ed u 血gn：I eb i l ed u c tr 印a i rp r o c e d u r eb yo b s e i I l gn l e曲r o b l a S tp r o l i f e r a t i o nm r o u 曲I I l i c r o s c o p e，e v a l m t 堍m ep r o l i f e r a t i o nb yM T Tm e m o da n da I l a l y s i s i n gm ea p o p t o s i sr a t e0 ff i b r o b l a S tb yd o u b l e-l a b e l e df l o wc”o m e 仃y n ee x p e 曲e n t a l 铲o u ps 曲u l a t e d 也eb i l i a 巧e n V 的n m e n tw i m1 b i l ea 1 1 d廿l ec o m r o l 伊o u pa d d e dt l l es 锄ed o s ec u l t u r es o l u t i o n R e s u l t sH i 曲e r 丘b r o b l a S tp r o l i f e r a t i o nw 嬲o b s e n，e db y1 1 1 i c r o s c o p ei ne x p e r i m e n t a l伊。o u po V e r 廿l ec o n 仃o lg r o u p 世e r4 8h o u r sb e i I l gc l d t u r e di 1 1s t i I I l u l a I l tb i l i a D，e n v i r o 砌e n t T h eO D 5 7 0V a l u eo ff i b r o b l 级、)I，i n ld i 脑e n tc o n c e 劬r a t i o nw 淞1 1 i g h e ri n浙江大学博士学位论文英文摘要e X p e r i m e l 吨a lg r o u pt h a I li nc o n _ 舡o l 铲o u p 硪e r4 8a 1 1 d7 2h o u r sb e i n gc u l t u r e di nb i l i a 巧e n v i r o 胁e n ts h o w e das 迳I l i f i c a n ts t a t i s t i cd i 虢r e n c e(P 0 0 5)n l ea p o p t o s i sr a t ew a Sl o w e ri 1 1e X p e 岫e n t a lg r o u pt 1 1 a 1 1i 1 1c o 肋o lg r o u pb yd o u b l e l a b e l e dn o wc”o m e 仃y(P o 0 5)。C o n c I u s i o nB i l ec a na c c e l e r a t em ef i b r o b l a s tp r o l i f e r a t i o na n dm ec o r l V e r s i o nt 0m y o f i b r o b l a 醍锄db i l ec a I li I 蚵b i tm ef i b r o b l a s t 印o p t o s i s I ti sc o n s i d e r e dt h a ti n n a l u n l i n a ls t e n te n d t o e n db i l ed u c ta n a S t o m o s i sc a ni s 0 1 a t et l l eS t i 瑚u l u Sa I l di n n u e n c eo f 赫a S t o m o s e s 缸I mb i l i a 巧e n v i r o l u n e n t，a I l dt os o r n ee)(t e n td e c r e a S e 廿1 eb i l ed u c te x c e s s i V eh e a l i n gb yf i b r o b l a S tp r o l i f I e r a t i o na I l dc o n V e n i o nt 0I n y o f i b r o b l a s tb e c a u s eo f t l l eb i l es t i r n u l a t i o 玛w m c hp r o V i d et l l em e o r e t i c a lb a s i sf o r 廿l en e x ta 1 1 i m a l 洲i e s K 舒w o r d sb i l e，f i b r o b l a 瓯印o p t o s i sP a r tI IA n i m a ls t u d i e so fi n t r a I u m i n a ls t e n tr e p a i ro fb i l ed u c td e f e c tw i t ha u t o l o g o u st i s s u ei np o r c i n emo d e lo b j e c t i、，eT ba L s s e s st 1 1 ef e a S i b i l i t)，a n ds a f e 够o fi n t r a l u m i l l a ls t e n tr e p a i ro fb i l ed u c td e f e c t、)l，i t l la u 幻l o g o u St i s s u e M e t h o d sAt o t a lo f3 0B 锄面I l i p i g sw e r em d o I l l l yc h o s e da I l dd i V i d e di n t 0t、)l，og r o u p s，15 洫e a c h E x p e r i m e n t a lm o d e l s、7 I，i mc o I n m o nb i l ed u c t(C B D)d e f e c t(1 O c ms e g m e n to fC B Dr e s e c t e d)w e r eb u i l tb y 砌m a ls u 玛e r y，n l ee x p e r i m e n t 越黟o u pw a sr e p a i r e db yal(i n do fi n _ 廿a J u I I l i m ls t e n t 丽t l l 黟e a t e ro m e n t u m，a l l dt l l ec o n 仃o lg r o u pw 2 L sf o 锄e dt 0b er e p a 沁db ye n d t 0 一e n db i l ed u c ta n a s t c m o s i s 1 1 1 c i d e n c eo fj a u n d i c e觚db i l el e a k a g ew a Se v a l u a t e di nb 以lg r o u p s F i V ep i g sw e r eb l l e de a c ht h ea t2w e e k s，1m o n 啦3m o n 血s 世e rt l l es u 玛e r i e s，C B C，V T T浙江大学博士学位论文英文摘要C R P，L i V e re r K 秒m e s(趾工A S T，A L P)a I l dS e m mt o t a lb i l i r 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tX浙江大学博士学位论文致谢致谢光阴如梭，在浙江大学的十年求学生涯即将结柬。在此谨对几年来，关心、帮助和支持我的良师益友以及亲人们，致以最诚挚的感谢。首先应当衷心地感谢我尊敬的导师蔡秀军教授，在临床工作、科研学习以及生活的方方面面给予了我无微不至的关怀、耐心的指导和培养，您严谨的工作作风和勇于创新、开拓进取的态度深深的影响了我，激励着我在今后人生道路上踏踏实实不断前进。在此，谨向恩师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢。感谢邵逸夫医院动物实验中心姚云斌和韩晶老师在动物实验中的辛勤付出和帮助。感谢中心实验室王琦老师、汤佳城的热情指导，帮助和鼓励。感谢邵逸夫医院病理科金梅主任、朱涛医师、徐静医师在病理制片及结果分析中对本实验的帮助和指导。感谢邵逸夫医院胡红杰主任、史晓酷医师在动物造影检查中的热情指导和无私帮助。感谢师兄虞洪、梁霄，郑雪咏、王一帆在我临床实践与手术技术上的无私教导，感谢师兄(姐)