细胞冻存(1).doc

细胞的冻存 细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存！！！ 一 材料： 生长良好之培养细胞 ，新鲜培养基， DMSO ，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片 。 二步骤： 2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形,最好细胞应该处于对数生长期。 2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。 2.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度。 2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。 2.5 接着置于-20℃冰箱，约30-60min。 2.6. 置于-80超低温冰箱中放置过夜。 2.7. 置于液氮罐中长期保存。 2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 三 注意事项： 3.1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存，提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO沉淀。冻存液比例培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，具体浓度视经验而定，但是好多人认为小牛血清含量越高越好！ 3.2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这 一温度区内，是“危险温区”。 可以先在泡沫上打孔，把冻存管塞进去。这样降温可以慢一点，当然包上棉花也是不错的主意 3.3 .注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。 3.4 -20°C 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍內，直接放入 -80°C 冰箱中，但存活率會降低一些。但是大多数人：4度半小时，—20度半小时，—80度过夜，液氮保存。 3.5 冷凍管內細胞數目一般至少為10*6-7/ml 以上，冻存细胞健康程度 一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存 3.6 细胞冻存管一般有1.5-2ml左右体积，原则上可以存放1.5ml充满均匀悬浮细胞的冻存液，一些人喜欢灌注1-1.5ml冻存液冻存，这实际上并不好。原因如下：冻存液冻存需要一段时间，如果这段时间冻存管倾斜，液体容易流到管口，很容易在后续的操作中造成污染。建议0.5-1ml之间即可。但是还是用1.5ml的话，具体操作时，冻存管直立起来放在-20的冰箱里，这样不容易造成污染。 同时冻存细胞的时候，一定加上封口膜，这样可以避免复苏的时候，水浴箱里的水进入盖子的缝隙中！冻存管外面用封口膜封上后，最好再用白胶布再封一下。这样可以防止细胞复苏时，封口膜崩裂，水浴箱中的水进入冻存管。 3.7 提醒;细胞冻存在-4度，或－20时就忘了，我干过好几次这样的事（这几次细胞种很好，很心疼），其实可以将冻存细胞时用厚厚的棉花把冻存管包起来，直接放进－70度冰箱，复苏效果也不错。