动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立-080125.ppt

动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立,秦启伟，黄晓红有害生物控制与资源利用国家重点实验室中山大学生命科学学院,2,第一部分（动物）细胞培养基本流程以及注意事项,3,细胞培养,细胞培养(cell culture)的含义，简单地说即是把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用。,4,单个细胞,原代细胞,细胞株,细胞系,剪碎，胰蛋白酶,分离细胞,原代培养,传代培养,（遗传物质没有发生改变）,（遗传物质发生改变）,动物组织,动物细胞培养基本流程,5,细胞培养的材料准备,1 细胞培养液2 胰酶消化液3 PBS缓冲洗涤液4 洁净无菌的细胞培养瓶、培养板,6,细胞培养基应用选择精要,选择培养基没有一定的标准，可供参考的几点建议：(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640。(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,7,培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。培养室的消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。,8,原代培养,用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养(Primary cell culture)。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶或其它方式消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。,9,动物细胞原代培养过程图,10,一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在46h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜(DMSO)的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。（2）取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4下存放2小时以上，再用PBS洗23次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。,原代细胞的取材,11,（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。,12,原代细胞的分离和制作,人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：,一、悬浮细胞的分离方法,组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞,13,二、实体组织材料的分离方法,（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。,14,（二）消化分离法,1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（）胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)分离方法如下：过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗23次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗23次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。（）胶原酶（Collagenase）消化法适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.10.3mg/mL。,15,2、非酶消化法（EDTA消化法）,常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好,消化分离法的操作步骤：（1）剪切 把组织块剪碎，呈15mm3大小的组织块。（）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37水浴中作用适当时间（中间可轻摇12次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或34层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降510分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。,16,1、组织块培养法,(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种2030小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37温箱内。(3)培养24小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养35天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。,原代细胞的培养方法,17,18,2.消化培养法,该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。,19,3.悬浮细胞培养法,对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。,20,原代和传代细胞的培养和维持,一、原代细胞的培养与维持,1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养),凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%80%在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。,21,2、悬浮细胞的培养,凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式,22,二、原代细胞培养的首次传代(Subculture),这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称之为传一代，传至510代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至1020代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。在早先传代时，其消化时间比一般已建系的细胞相对长一些。(3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的机械损伤。(4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。(5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大至15%20%左右。,23,三、传代细胞的传代培养,(1)吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。(2)每瓶加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用23分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。(4)加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤(5)用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。,24,四、传代细胞的建系和维持,1.细胞档案细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性（由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等）、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间(分裂指数)，细胞的特殊遗传标志(标记染色体)等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。2.换液传代(1)细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。(2)多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉每传5代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。3.细胞系（或株）的鉴定和管理,25,细胞的纯化和克隆,一、细胞的纯化,(一)自然纯化,自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的。,(二)人工纯化,1、细胞因子依赖纯化法,人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和生长繁殖,2、酶消化法,不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的，对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。,3、机械刮除法,4、反复贴壁法,5、电烙筛选法,26,二、细胞的克隆化,细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株(cell strain)。,1.毛细管法 2.有限稀释法 3.平皿克隆分离法4.软琼脂克隆分离法5单细胞显微操作法,27,六、冻存和复苏的原则：慢冻快融,冷冻保存要点冷冻过程要缓慢。4 3060 分钟-20 30 分钟-80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：11075107/ml。常用细胞冷冻保存液10DMSO 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）,28,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,29,按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型,成纤维细胞型胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状、火焰状、漩涡状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌细胞等等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。,上皮型细胞细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜，生长时呈膜状移动，起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,游走细胞型在支持物上呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。多型细胞型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,30,悬浮型细胞：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于某些癌细胞和血液淋巴细胞 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来自血，脾或骨髓 在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态 观察不方便,31,微生物污染的检测,细菌和真菌的污染和检测 肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法,32,33,第二部分石斑鱼不同组织的原代和传代细胞培养,34,建立了对神经坏死症病毒和虹彩病毒敏感的石斑鱼脾细胞系（GS）(Qin,et al.,2006,Journal of Virological Methods),Fig.2.GS细胞系的染色体核型分布。GS细胞系由48条染色体组成,Fig.1.正常培养的单层GS细胞(100代）,感染虹彩病毒（A，B）和神经坏死症病毒（C，D）的GS 培养细胞。,透射电镜观察受虹彩病毒（A）和神经坏死症病毒（B)感染的GS细胞。,免疫荧光抗体染色。（A）非感染对照细胞，（B）感染虹彩病毒的GS细胞,GS细胞转染绿色荧光蛋白基因（GFP）。,38,2.1 石斑鱼不同组织原代细胞和传代细胞的培养,39,40,41,2.2石斑鱼不同组织细胞的病毒敏感性试验形态学观察,42,43,44,2.2石斑鱼不同组织细胞的病毒敏感性试验 SGIV单克隆抗体免疫荧光检测,45,2.3石斑鱼不同组织细胞的转染实验,