基因组DNA的提取B20~30-3.doc

浙江省第四届大学生生命科学学科竞赛 实验记录 序号： 6 实验时间： 7月 16日 — 7月 18日 鲍曼不动杆菌基因组DNA提取 【实验目的】 1、掌握细菌基因组DNA提取的原理和方法； 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 【实验原理】 一、基因组DNA提取： 细菌的核酸分为两类：DNA和RNA，DNA主要存在于染色体中，RNA主要存在于细胞质中。因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是经阴离子去污剂结合蛋白酶裂解细菌之后，利用CATB，酚抽提法去除多糖、蛋白质、RNA等杂质，并选择性沉淀得到较纯DNA。 提取DNA的反应体系中， SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在高温（55-65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；EDTA可抑制细胞中Dnase的活性；苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用，反复抽提，使蛋白质变性沉淀于水相和有机相之间。苯酚、氯仿抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐。对于一般的样品（杂质为蛋白质），该方法完全可以获得高质量的核酸。 二、琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳技术（agarosegelelectroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有电荷效应与分子筛效应。它首先利用琼脂糖凝胶的分子筛效应，将大小不同的片段分离开来；此外，在弱碱性条件下，DNA 分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。 借助溴化乙锭（EB）能与双链 DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。还可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。 【实验材料】 1、 实验菌株： 从××医院临床分离的11株鲍曼不动杆菌B20-B30。 2、实验试剂： LB液体培养基、STE缓冲液（0.1mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA）、GTE缓冲液（50mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA）、TE缓冲液（PH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA）、5mol/L NaCl、2%SDS、100mg/mL溶菌酶、10mg/mL RNaseA、Tris-饱和酚（Tris-phenol）、氯仿（chloroform）、无水乙醇（Ethanol）、NormalRunTM 1kb-Ⅱ qDL 10002、1×TAE电泳缓冲液、溴化乙锭水溶液（10mg /mL）、上样缓冲液（6×loading buffer）。 3、实验仪器： 安泰超净工作台、指针式电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）、GL-88B漩涡混和器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、UNIVERSAL 32R台式冷冻高速离心机、HZQ-IX 全温振荡器（中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）、迷你水平电泳槽BG-subMiNicell（北京百晶生物技术有限公司）、凝胶成像仪（tanon 1600R）、微波炉、制胶槽及配套的梳子、凝胶槽、METTLER TOLEDO 电子分析天平、eppendorf Research plus移液器（量程分别为100~1000μL、20~200μL、2~20μL、0.5~10 μL）、移液器吸嘴、Eppendorf离心管（规格：1.5mL 或2.0 mL）、50mL离心管、无菌手套（乳胶手套和一次性EP手套，与操作者手形相适应）、移液管（1mL、2mL、5mL、10mL）、洗耳球、量筒（量程100mL、1000mL）、玻璃棒、2000mL烧杯、玻璃管、吸水纸、镊子、记号笔、试管架。 【实验步骤】 1、分别挑取B20~B30的单菌落接种于 2mL LB - AMP液体培养基中，标记B20~B30，37℃振荡培养过夜。 2、分别取出200μL菌液加 2mL的LB - AMP液体培养基，作1:10稀释，37℃摇床（转速250rpm ）扩大培养2-4小时。 3、取1.5mL菌液于一微量离心管中，12000 rpm 离心1 min，弃去上清，倒置于吸水纸上吸干。 4、加入500μL STE ，用移液器吸动打匀，使细菌重新悬浮， 12000 rpm离心1 min，弃去上清，使细菌沉淀尽量干燥。 5、加入100μL的GTE 和5μL的溶菌酶，用移液器轻轻吸动打匀，冰上过夜。 6、加入200μL 2% SDS， 温和混匀至透明黏稠状，50~60℃温育30min。 7、加入200μL的NaCl（5mol/L），颠倒混匀，室温静置5~10min。 8、加入等体积的酚：氯仿（体积比1:1）抽提一次，12000rpm离心5min，将上清转移到另一微量离心管中。离心后的水层如混浊则说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不再有白色沉淀物为止。 9、加等体积的氯仿，充分混匀后12000rpm离心5min。 10、离心后，小心吸取上层水相（尽量避免吸取中间层），移至另一微量离心管中，并记录体积，加入0.6倍体积的异丙醇，于-20℃冰箱放置20min，12000rpm离心10min，可见白色丝状沉淀物。 11、弃上清后用500μL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，12000rpm离心5min。小心弃去上清，37℃烘箱放置5-10min，挥干乙醇。 12、加入20μL TE（含20μg/mL的RNase）溶解DNA， 37℃水浴10min。　 13、琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取结果： （1）制备1%琼脂糖凝胶：称取0.5 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入1×TAE 50mL，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 （2）胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗净，晾干，放入制胶玻璃板，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子，将冷却到50~60℃左右的琼脂糖凝胶液加入EB混匀，EB的终浓度为0.5μg/mL，小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。凝胶的厚度在3～5mm之间，检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。 （3）加样：在点样板上将2μ L DNA样品和1 μL 上样缓冲液混匀，用加样枪依次加入凝胶样品孔中，同时将DNA Ladder加入另一孔中（注意：加样前先记下加样的顺序）。 （4）电泳：盖上电泳槽，接通电源，以5v/cm的电压进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳，取出凝胶。 （5）拍照：采用凝胶成像系统拍照，保存，并与核酸分子量标准比较基因组片段的大小。 【实验结果】 取2μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳后结果见图1 图1 ： B20~B30的基因组DNA凝胶电泳图 Fig. 1 Electrophoresis of B20~B30 DNA M：1kb DNA Ladder；1-11：B20~B30基因组DNA 【实验结果分析】 电泳结果显示，B20~B28和B30基因组DNA条带清晰明亮。 B27、B28泳道加样孔比较明亮，说明DNA中还有较多蛋白，如影响后续PCR扩增，则应重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质。 B29基因组条带很暗，DNA提取量少，分析原因，可能为：（1）实验材料不佳或量少；（2）破碎或裂解不充分；（3）沉淀不完全；（4）洗涤时DNA丢失。下次实验重新提取，并做适当改进：（1）适当延长扩大时间，增加菌液浓度；（2）60℃高温裂解时，时间适当延长；（3）延长-20℃低温沉淀时间；（4）注意动作轻柔，避免丢失。 【注意事项】 一、DNA提取实验： 1、抽提过程中应尽量保持低温。 2、细菌DNA制备过程中去蛋白很重要，因为蛋白含量过高可能影响限制酶酶切效果。采用酚/三氯甲烷去蛋白较单纯用酚或三氯甲烷好，以清除杂质来解决限制性内切酶切割等问题。 3、三氯甲烷可使蛋白质变性并有助于液相和有机相分离。酚和三氯甲烷均有较强的腐蚀性，操作时要尽量戴手套。 4、各操作步骤要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。 5、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。 6、所有的试剂都要经过灭菌双蒸水配制。 7、基因组应4℃保存，如-20℃可能会导致DNA断裂。 8、在试验准备过程中应将DNA样品放在碎冰上。 9在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或者适当延长离心时间。 10、所操作菌为条件致病菌，要按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。 二、琼脂糖凝胶电泳： 1、电源接通前应该核实凝胶的方向是否放置正确。 2、电泳过程中，电泳缓冲液刚没过凝胶1mm为好，太多则电流加大，凝胶发热。电泳时凝胶上所加电压一般不超过5v/cm（指的是正负极之间而不是凝胶的长度）。 3、应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。 4、电泳仪有电压不一定标志电泳槽已经接通，应该观察正负极铂金丝之间是否有气泡出现，如负极的气泡比正极的多一倍，表示电泳槽已接通电源，几分钟之后可见指示剂溴酚蓝向正极移动。