组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞(1).pdf

基金项目:国家重点基础研究规划(973)项目(G2000056905).通讯作者:杨永宗,湖南南华大学心血管病研究所,421001.E-mail:YZYang ,Tel:0734-8281288.作者简介:李悦梅,女,生于1973年8月,新疆石河子人,南华大学心血管病研究所病理与病理生理学硕士研究生.主要从事高血压病的血管重构研究.E-mail:meilyVc .第31卷第3期Vol.31 No.3南华大学学报 医学版Journal of Nanhua University(Medical Edition)2003年9月Sep.2003组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞李悦梅1,冯大明1,万载阳1,王 双1,沈丹彤2,赵桂玲2,杨永宗1(1.南华大学 心血管病研究所,湖南 衡阳421001;2.第一军医大学 微循环实验室)摘 要:利用贴块法成功地大量培养了大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞。培养的细胞经光镜和免疫组化鉴定为平滑肌细胞。方法简便,经济,为阻力血管的细胞水平的研究提供了实验材料。关键词:平滑肌细胞;培养;小动脉;组织中图分类号;R543 文献标识码:A 文章编号:1000-2510(2003)03-0251-03The Method of Culturing the Smooth Muscle Cells From TissuePieces of Cremasteric Arterioles of RatLI Yue-mei,FENGDa-ming,WAN Zai-yang,et al(Institute of Cardiovascular Disease,Nanhua University,Hengyang,Hunan421001,China)Abstract:The smooth muscle cells derived from tissue pieces of cremasteric arterioles of rat were cultured suc2cessfully in quantity and were identified by immunohistochemistry and light microscopy.The method is characteristicof simple and economical and useful materials for the study on the resistant vessel in cellular level.Key words:smooth muscle cell;culture;arteriole;tissue阻力血管的病变是高血压病的主要病理生理学基础,肠系膜阻力血管又是全身阻力血管的主要组成部分,研究其平滑肌细胞的机能具有重要意义。目前,在高血压发病机制的研究中,有关动脉平滑肌细胞水平的研究,大多采用体外培养主动脉、肺大动脉等大血管的平滑肌细胞,这可能是小动脉的分离培养较困难所致。国外有文献报道用酶消化法分离肠系膜小动脉的平滑肌细胞,但操作麻烦、费用较高1。胡得辉等2用贴块法成功地培养了兔肺内小动脉的平滑肌细胞,但因肠系膜小动脉分离较困难,故贴块法是否适应于肠系膜小动脉的培养,尚无文献报道。本文成功应用贴块法体外培养大鼠肠系膜小动脉平滑肌细胞,为高血压病及休克等其它病理生理过程中阻力血管细胞水平的研究提供了实验材料。1材料与方法1.1培养基与试剂 DMEM:GIBCO公司;新生小牛血清(NCS):杭州四季清生物研究所(批号:020521:2);胰蛋白酶(Trypsin)和HEPES:上海生物工程公司;抗平滑肌Actin单克隆抗体和免疫组化染色试剂盒:武汉博士德生物公司;其它试剂均为市售分析纯。1.2 原代培养与传代1.2.1 取材与原代培养 健康成年SD大鼠,雄性,体重180230 g,断头处死。放入75%乙醇中灭菌2 min,无菌操作打开腹腔,仔细剪取肠系膜血管床,放入HPSS缓冲平衡液中(HPSS mmol/L:NaCl 130,KCl 5,MgCl2、CaCl2各1.5,HEPES 10,glucose 10,pH 7.2)平衡20 min。用纤维外科镊仔细分离肠系膜二级以下分支动脉(直径 100m)。152将分离出的所有小动脉均集中起来,再用HPSS液漂洗后,放入盛有含20%NCS的DMEM培养基EP管中。用眼科剪仔细反复将小动脉剪碎,静置3 min,吸除上清和悬浮组织,沉淀用含20%NCS的DMEM培养基冲洗,再静置5min,吸除悬浮组织和上清液。将沉淀组织均匀地种于25mL的培养瓶上壁,再加入含20%NCS的DMEM培养基约23 mL,注意避免培养基与种植面接触,置于37 含5%CO2的空气的培养箱中安静培养45 h,再轻轻地翻转培养瓶,使培养基浸没组织块。绝对静置培养3 d后,5 d换液一次。于第57天,在光镜下观察,有梭形的细胞从组织块边缘长出(见图1)。于第1012天长成密集的不均匀的单层或多层细胞。1.2.2换液 原代培养时的换液:吸出培养瓶中的旧培养液,再加含20%NCS的DMEM约3 mL。传代培养时的换液:吸弃旧培养液后,加DHanks液约2 mL于瓶中,轻摇后吸去,再加入含10%NCS的DMEM。1.2.3细胞传代 原代培养的细胞长满后,将培养瓶中旧的培养基弃除。加DHanks液约2 mL于瓶中,轻摇以清洗旧的培养基,吸弃液体后加入0.25%胰蛋白酶消化液,其量以没过细胞表面为度。于光镜下观察,可见细胞逐渐松散,彼此分离,收缩。翻转培养瓶,使细胞离开消化液,吸除消化液,加含10%NCS的DMEM,用吹打管轻轻将细胞吹打下来。细胞悬浮液以1瓶传代2至3瓶,补足培养基。1.2.4差异贴壁法纯化细胞 细胞传至3代后,按传代方法消化,吹打细胞,然后使细胞在第1瓶中贴壁15 min,光镜下可见部分细胞贴壁;后将第1瓶中培养基移入第2瓶中,使细胞贴壁15 min,光镜下又可见大部分细胞贴壁;最后再将第2瓶中培养基移入第3瓶中,再使细胞贴壁,后将3瓶均补齐培养基。继续培养12 d后,光镜下观察,第1瓶中以较大长梭形细胞为主,为成纤维细胞;第2瓶为混和细胞;第3瓶中为较纯的梭形平滑肌细胞;取第2瓶细胞继续培养。也可重复纯化几次,获得较纯的平滑肌细胞。1.2.5冻存与复苏 纯化后传代的细胞长成致密单层后,用传代方法消化细胞,加1 mL的含20%NCS、10%DM2SO的DMEM,吹打细胞,制成悬液(细胞密度大于5106个/mL),移入安瓿中,密封。4 中存30 min,移入-20存10 h,后存入-80 冰柜中保存,或过夜后再移入液氮中保存。复苏时,取出安瓿迅速浸入37水中,不断摇动,使其于1 min左右解冻。取出安瓿,用70%乙醇擦外表消毒,在超净台上打开盖,吸出细胞悬液移入离心管,并加5mL DMEM,500 r/min离心5 min,吸除上清,重新加入5 mL含10%NCS的DMEM,轻轻吹打细胞,使其重悬,将细胞悬液移入培养瓶中,置培养箱中培养,次日可见贴壁生长的细胞。1.3免疫组化 将消化下的细胞接种培养在盖玻片上,贴壁后,用PBS洗3次,每次5 min,以洗去残留的培养基,然后用95%的乙醇固定10 min,用SABC法,按照博士德公司免疫组化试剂盒说明书的步骤进行操作,用抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体定性检测平滑肌肌动蛋白。2结 果2.1 培养出的细胞中含有一些杂细胞,经过差异贴壁法纯化和传代,细胞逐渐得到纯化,传至第6代时,经光镜和免疫组化鉴定为平滑肌细胞,纯度大于95%(光镜下观察免疫组化后的细胞50个,折算阳性细胞百分比)。经台盼蓝染色,活细胞达99%。2.2 光镜观察 原代培养的细胞在光镜下可见从组织的边缘长出长梭形,饱满的细胞。逐渐增多(图1)。传代后培养的细胞贴壁生长,梭形,成丛地排列呈现放射状或旋涡状(图2)。2.3 免疫组化检测结果 在光镜下可见平滑肌细胞的胞浆内大量棕色的、与细胞长轴平行的纤维细丝,即平滑肌肌动蛋白丝。见图3。图1 原代培养的平滑肌细胞(500)右下角棕色血管段的边缘长出梭形的平滑肌细胞图2 第6代平滑肌细胞(200)形态为梭形或长梭形,细胞呈放射状或旋涡状排列252 图3 平滑肌细胞免疫组化结果(1 000)胞浆内可见平行排列的棕色细微丝3讨 论肠系膜阻力动脉在全身阻力血管中占有重要位置,同时,肠系膜小动脉比较孤立,周围没有过多的组织,获取相对直观且容易,因此肠系膜小动脉的平滑肌细胞的培养对于研究病理及生理过程中的阻力血管的变化具有重要意义和一定优势。关于大动脉的平滑肌细胞的培养国内外早已有较多报道3,方法也被广泛采用,一般为酶消化法和贴块法。肺小动脉的平滑肌细胞培养也有文献报道2。目前,有文献报道用酶消化法分离得到小动脉的单个平滑肌细胞1,4,5,但未见其大规模体外传代培养的报道。本实验首次采用贴块法体外培养了肠系膜小动脉平滑肌细胞。培养过程中,体会有几点:(1)肠系膜小动脉取材较困难,需要较长的时间,应尽快取材,并将其放入HPSS中,仔细分离小动脉也要在HPSS中进行,它是一种很强的缓冲液,有利于较长时间保持血管的活性。分离小动脉时尽量将血管外的脂肪组织分离干净,得到光滑的血管段。(2)按照文献2,在体用0.1%的胰蛋白酶灌洗肠系膜动脉以去除内皮,但考虑到所需的时间较长,操作较繁琐,因此去除此操作,用传代培养时的差异贴壁法同样去除了混杂的内皮细胞和成纤维细胞。差异贴壁法是利用成纤维细胞贴壁最快,其次是内皮细胞而平滑肌细胞贴壁最晚的特点纯化细胞的6,7。故本实验中的第3瓶细胞是较纯的平滑肌细胞,但每瓶的贴壁时间不一定是方法部分所示,也可略有差别,需要实验者据光镜观察结果灵活掌握。(3)操作过程中,在装有培养基的1.5 mL EP管中剪碎血管时,要将血管尽力剪碎,约成1 mm1 mm1 mm的细颗粒,并反复用培养基冲洗,因带有少量脂肪组织的外膜比重大于培养基,故在静置一段时间后,外膜悬浮在培养基上部,而比重大的平滑肌组织小颗粒沉淀于底部,将外膜连同培养基一起吸除,从而去除部分外膜。重复此操作又可进一步除外膜。小动脉的外膜和内膜的去除较困难,但不去除又会影响平滑肌细胞的纯度,本实验在参考文献的基础上基本解决了此问题。(4)本方法简便,经济。需要的唯一特殊器械是一把显微外科镊,市场容易买到。故一般实验室均可做到。本法所得细胞纯度高,活性好,操作简便,为小动脉平滑肌细胞的研究提供了实验材料,也是灵活应用细胞培养方法的一个实例。参考文献:1Jackson WF,Huebner JM,Rusch NJ.Enzymatic isolationand characterization of single vascular smooth muscle cellsfrom cremasteric arteriolesJ.Microcirculation,1997,4:35.2 胡德辉,刘惠君,马传桃.兔肺内小动脉平滑肌细胞培养J.Chin J Appl Physiol,1997,13(1):80-82.3Ross R,G lomset JA.Atherosclerosis and the arterialsmooth muscleJ.Science,1973,180:1332-1339.4 刘 杰,赵克森,金春华.肠系膜细动脉平滑肌细胞的分离及其ATP敏感钾通道特性J.第一军医大学学报,1998,18(1):18-21.5Seidel MF,Simard JM,Hunter SF,et al.Isolation of arte2riolar microvessels and culture of smooth muscle cells fromcerebral cortex of guinea pigJ.Cell Tissue Res,1991,256:579.6 司徒镇强,吴军正.细胞培养M.西安:世界图书出版公司,1996.77-78.7 王关嵩,杨小静,钱桂生,等.大鼠平滑肌细胞分离培养的探讨J.第三军医大学学报,1998,20(4):348-350.(收稿时间:2003-03-05)352