基因定点突变(1).pdf

基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理通过设计引物，并利用 PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的 PCR产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为 2545 bp，我们建议引物长度为 3035 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要 11-12 个 bp 才能与模板搭上，而这种突变PCR 要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少 12 个 bp，并且合成多一条反向互补的引物。（2）如果设定的引物长度为 30 bp，接下来需要计算引物的 Tm 值，看是否达到 78（GC 含量应大于 40%）。（3）如果 Tm 值低于 78，则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78（GC 含量应大于 40%）。（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。（5）最好使用经过纯化的引物。Tm 值计算公式：Tm=0.41(%of GC)675/L+81.5注：L：引物碱基数；%of GC：引物 GC 含量。四、引物设计实例以 GCGACG 为例：5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3（1）首先设计 30 bp 长的上下游引物，并将 A(T)设计在引物的中央位置。Primer#1:5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3Primer#2:5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.4140-675/30+81.5）。通过计算可以看出其 Tm 低于 78，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。（3）重新调整引物长度。Primer#1:5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3Primer#2:5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物两端加 5mer（斜体下划线处），这样引物的 GC 含量为 45.7%，L 值为 35，将这两个数值带入 Tm 值计算公式，得到其 Tm 为 80.952（Tm=0.4147.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。五、突变所用聚合酶及 Buffer引物和质粒都准备好后，当然就是做 PCR 喽，不过对于 PCR 的酶和 buffer，不能用平时的，我们做 PCR 把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个 K，所以要用那些 GC buffer 或扩增长片段的 buffer，另外，要用保真性能较好的 PFU 酶来扩增，防止引进新的突变。除了使用基因定点突变试剂盒，如 Stratagene 和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速 taq 酶、Takara 的 PrimeSTARTMHS DNApolymerase。六、如何去掉 PCR 产物最简单的方法就是用 DpnI 酶，DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而 PCR 产物都是没有甲基化的，所以 DpnI 酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响 PCR 产物，从而去掉模板留下 PCR 产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI 处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。七、如何拿到质粒直接把通过 DpnI 处理的 PCR 产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。八、图示九、定点突变操作步骤A 诱导突变基因（PCR 反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及 Muta-direct酶进行 PCR 扩增反应，诱导目的基因突变。1.设计点突变引物。注参考引物设计指导2.准备模板质粒 DN A注用dam+型菌株（例如 DH5菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒 DNA 时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。3.选项对照反应体系（50l 反应体系）10Reaction Buffer5lpUC18 control plasmid（10ng/l，total20ng）2lControl primer mix（20pmol/l）2ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l4.样品反应体系（50l 反应体系）10Reaction Buffer5lSample plasmid（10ng/l，total20ng）2lSample primer(F)（10pmol/l）1lSample primer(R)（10pmol/l）1ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l5.PCR 反应条件注按如下参数设置 PCR 扩增条件。CyclesTemperatureReaction Time1cycle9530sec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6.PCR 扩增反应完成后冰育 5 分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。注 按下列提供的 PCR 条件进行扩增，控制 PCR 循环数。注意当突变点位点超过 4 个时会发生突变率降低的现象。MutationCycles12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB 突变质粒选择PCR 反应结束后使用 Mutazyme酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒 DNA。1.准备 PCR 反应产物2.加入 1l（10U/l）Mutazyme酶 37温育 1 小时。注当质粒 DNA 用量过多时 Mutazyme酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加 Mutazyme酶用量。C转化反应完毕后在质粒 DNA 上会产生缺口，当把这个质粒 DNA 转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如 DH5。1.将 10l 样品加到 50l 感受态细胞里，然后放置在冰上 30 分钟。2.接下来可以参照一般的转化步骤进行。序列分析通常当 LB 平板上出白色菌落则表明发生了突变。为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。