肿瘤干细胞培养技术分享.docx

原创：超哥 肿瘤干细胞培养技术 肿瘤干细胞起源： 最初形成肿瘤的不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤起始细胞有时能和CSCs互换；CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs存在的最佳证据来源于对恶性血液疾病急性白血病的研究；CSCs也被很多学者称之为肿瘤传播细胞（Tumor propagating cells, TPCs）；图中显示：CSCs不仅可以来源于正常干细胞的突变，还可以由祖细胞分化的细胞获得无限增殖潜力而形成、由分化的细胞去分化后突变形成。 肿瘤干细胞特征： 1、CSCs的迁移对肿瘤远处转移的影响：CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些细胞能够进行连续传代，说明其具有自我更新能力（Self-renewal capacity），且能够通过制造分化的、非致瘤的子代从而产生肿瘤异质性；临床生存分析也表明CD133和肿瘤患者的无疾病生存和总生存率相关；还发现，经历上皮间充质转化（EMT）的肿瘤细胞呈现CSC特性。 2、CSCs具有一些干细胞的特征，如休眠、DNA修复机制激活以及对细胞凋亡的天然抗性等。 3、CSCs对治疗耐受； Ref: Drug Discov Today, PMID: 24819719 其耐受的主要机制包括：药物外排，最经典的耐药机制为ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白、抗凋亡通路、干扰细胞分化、乙醛脱氢酶、缺氧环境等等。 肿瘤干细胞的分离：荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠细胞分选（MACS）是分选CSCs的主要技术；FACS是通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及细胞标志物CD44、CD133等的表达方式来分离细胞；MACS是肿瘤干细胞分选的标准方法，根据特殊的肿瘤干细胞标志物，如CD133的表达来分离细胞。 图中是FACS和MACS常用的仪器流式细胞仪和免疫磁珠分选装置。 肿瘤干细胞标志物： Tumor type Cell surface marker References Acute myeloid leukemia (AML) CD34+, CD38- PMID: 21318290 PMID: 19858069 Breast cancer EPCAM(ESA)+, CD44+, CD24-, ALDH, CD29, CD133 PMID: 16449977 PMID: 12629218 Ovarian cancer CD133+, CD44+, CD117+, CD24+ PMID: 18775674 Glioblastoma CD133+, CD15+ PMID: 15549107 Medulloblastoma CD133+, CD15+ PMID: 18567795 Small cell and none-small cell lung cancer CD133+ PMID: 22387005 Hepatocellular carcinoma CD45−, CD90+ PMID: 22824809 Colon cancer CD133+, CD44+, CD26+, ALDH PMID: 17122772 PMID: 17122771 Tumor type Cell surface marker References Melanoma CD20+, CD271+ PMID: 16230395 Pancreas adenocarcinoma CD44+, CD24+ PMID: 17122772 Renal carcinoma CD133+ PMID: 17122772 Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) CD44+, ALDH1 PMID: 18539956 LUNG CD133+, CD90, CD117, ALDH1 PMID: 19805294 Prostate cancer CD44+, CD133+, CD49 PMID: 16449977 表中是各类肿瘤的CSC标志物，如急性髓系白血病干细胞呈现CD34阳性、CD38阴性；乳腺癌干细胞呈现ESA、CD44和ALDH阳性以及CD24阴性；卵巢癌干细胞呈现CD133、CD44、CD117和CD24阳性等。 肿瘤干细胞培养技术： 实验室经典的CSCs分选方法为荧光激活细胞分选（FACS），现在比较常用FACS为侧群（Side-population）分析，其原理主要为用Hoescht 33342和Rhodamine 123染色细胞，CSCs具有高耐药能力，能够排除染料，从而分选出这类不被染色细胞，即CSCs；其缺点主要在于：耗时长、技术含量高及得到的分选细胞少。 图中是FACS实验操作的示意图，首先用特异抗体或染料标记细胞，经过流式细胞仪分选得到被标记或不被染色的细胞，再将这些分选的细胞继续培养，用于后续实验。 另一种CSCs分选方法为磁珠细胞分选（MACS）；其操作比较简便，但是一次只能够分选一个标志物； 图中是MACS实验操作示意图，首先将特异性的免疫磁珠标签于肿瘤细胞，带CSC标志物的细胞将会被标签；用磁珠分选装置分选细胞，将带有标签的细胞吸附于分选装置上，其余细胞被洗脱；最后将标签细胞从分选装置上洗脱下来继续培养。 分选得到的细胞进行后续培养，培养的方法主要为微球培养法； 图中模式图显示：传统细胞培养技术的主要特点是将细胞培养于高血清培养基中，细胞平铺生长于培养瓶底部；而微球培养技术是将细胞培养于无血清（serum-free）培养基及超低黏附培养瓶中，在这种条件下，分化的细胞将会死亡，CSCs会继续存活并增殖形成悬浮的肿瘤细胞球。 乳腺癌干细胞（Breast cancer stem cells, BCSCs）培养模式采取的是分选后再进行肿瘤微球培养； 6孔超低黏附（吸附）培养板 T25超低黏附培养瓶 （美国Corning公司） 首先需要的是超低黏附培养板或超低黏附培养瓶，培养所需其他材料还包括细胞培养基、细胞因子及其他添加试剂等，如DMEM/F12基础培养基、重组人表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、双抗、B27、胰岛素等。 培养BCSCs实验步骤主要为： 1、 配置BCSCs培养基， 上图中显示了配置50 mL BCSCs培养基所需要添加的各种试剂浓度及体积。 2、将分选后的细胞接种于超低黏附培养板，一般使用6孔板，添加4 mL BCSCs培养基，以一定的梯度接种，一般为1000~20000个细胞/孔，以确定后期细胞传代的密度及该密度下细胞的生长周期。 3、对生长过程中的BCSCs进行拍照：一般隔天进行拍照，如0/2/4/6或0/1/3/5/7天进行拍照，拍出来的效果如图所示 上图为乳腺癌细胞MDA-MB-231的肿瘤干细胞第0/2/4/6天图片，右边为对比的普通肿瘤细胞； 下图为是鼠来源的乳腺癌细胞4T1的肿瘤干细胞第0/1/3/5/7天图片； 可以发现其细胞生长前期长势慢，后期快，一般一周左右传代一次，中途需要添加BCSCs培养基。 4、裸鼠移植瘤实验检测分选培养的CSCs的体内成瘤能力；这个实验需要对比肿瘤干细胞和对应的普通肿瘤细胞的体内成瘤能力，两种细胞的注射密度不一致，肿瘤干细胞的体内注射密度可以比普通肿瘤细胞低2~3个数量级，实验流程如示意图所示； 此项实验注意事项为：首先，建议做体内移植瘤之前用流式细胞术检测所培养CSCs的干细胞标志物比率，如BCSCs的干细胞标志物CD44和CD24等，既能说明培养方式未使CSCs分化或分化减少，又能保证体内移植瘤实验的成功率；体内移植瘤模型，一般皮下成瘤即可，原位移植瘤当然更好；且实验过程中，既要关注移植瘤的成瘤率，还要关注其成瘤时间，可在伦理准许范围内适当延长实验时间，以保证实验的准确性。 5、体外检测CSCs相关因子及干细胞标志物等； 如图所示，免疫荧光检测乳肿瘤干细胞微球体干细胞生物标志物CD44/CD24/ALDH的表达情况显示：CD44/ALDH高表达、CD24低表达； 检测干性相关因子Nanog/Oct-4/Sox-2/C-myc，如图所示， 对比普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞的干细胞因子表达量，发现Nanog/Oct-4/Sox-2均在肿瘤干细胞微球体中高表达；但是一般不建议进行对比，因为两种细胞的培养条件完全不一致；检测肿瘤干细胞自我更新能力，如图所示： 肿瘤干细胞传代20次后仍能保持微球状态而未分化；检测CSCs的上皮间充质转化（EMT）相关指标，一般较少单独检测，除非做到EMT相关转移研究。 结直肠癌干细胞培养： 基本和乳腺癌干细胞培养一致；首先配置结直肠癌干细胞培养基， 跟BCSCs培养基的配置相比差别较大，只需要加入常用的几个细胞生长因子；干细胞相关标志物也不同，结直肠癌干细胞标志物一般检测CD133/CD44等，下图是细胞免疫组化检测干细胞标志物结果。 极限稀释法（ELDA）检测肿瘤干细胞特征：体外极限稀释法如示意图所示， 首先消化肿瘤干细胞制成单细胞悬液，细胞计数，按照一定密度种板，3周后观察96孔板中形成肿瘤微球的孔板，用极限稀释法在线软件计算肿瘤球形成频率； 细胞接种时的密度、稀释方法、所需要的96孔板孔数以及培养板数如图表所示。 Cell concentration (#cells/well) Number of 96 well plates Number of wells 1,000 0.25 24 100 1 96 1 2 192 体内极限稀释法如示意图所示， 细胞经消化计数后吸入注射器中，同时还要加入基质胶以保证成瘤率，然后注射入小鼠体内，一只小鼠注射两次；这是细胞注射密度以及稀释方法；所需的注射器数及小鼠数量以及简化的实验步骤和计算网站如图表所示。