基因敲除（CRISPR Cas）(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 基因敲除基因敲除（CRISPR/CasCRISPR/Cas）1.1.实验原理实验原理 CRISPR/Cas9 是一种新型的基因组编辑技术，拥有操作简单，效率高，以及作用靶点多等优势，逐渐成为基因敲除，基因组突变和基因敲除等实验的标准操作工具。Cas9 系统能在 293T,K562,iPS 等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，进而引导非同源重组（NHEJ）或同源重组（HR），效率在 3-25%之间。在向导 RNA（guide RNA，gRNA）和 Cas9 蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组 DNA 将被看作病毒或外源 DNA，被精确剪切。如果在基因的上下游各设计一条向导 RNA（向导 RNA1，向导 RNA2），将其与含有 Cas9 蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导 RNA 通过碱基互补配对可以靶向 PAM 附近的目标序列，Cas9 蛋白会使该基因上下游的 DNA 双链断裂。而生物体自身存在着 DNA 损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体 DNA 分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。这样就可以实现基因的替换或者突变。对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。解螺旋 http:/ 敲除目标基因。3.3.实验实验材料材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 Cas9 质粒、LB 培养基/LB 琼脂培养基、NaCl、TrisHCl、T4 DNA 连接酶等 3.2.3.2.主要仪器主要仪器 稳压电泳仪、凝胶成像仪、细菌摇床、生化培养箱、PCR 仪、高速离心机等 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 4.4.实验步骤实验步骤 4.1.4.1.寻找目的基因的靶标寻找目的基因的靶标 登录在线设计网站 CRISPR direct。靶点挑选要点：1.基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内；2.不同 Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上有较大差异，因此同时设计构建 23 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。3.N1-N20 NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 712 个碱基的错配对 Cas9切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行 BLAST 检测。4.Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距 2030bp的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。4.2.4.2.插入片段设计插入片段设计 1.插入寡核苷酸序列设计（必须 PAGE 纯化寡核苷酸）：正向序列 5ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3 反向序列 3TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5 2.插入片段的合成 用水将寡核苷酸稀释为 100 M。按以下体系配制退火反应体系：正义寡核苷酸（100 M）5l 反义寡核苷酸（100 M）5l NaCl 100 mM（终浓度）TrisHCl pH 7.4 50 mM（终浓度）加水补足 50 l 将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置 PCR 仪上，运行以下程序：904 min，70 10 min，55 10 min，40 10 min，25 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在20 长期保存。解螺旋 http:/ 陪伴医生科研成长 http:/ 3 4.3.4.3.pCas9/gRNA pCas9/gRNA 基因敲除载体的构建基因敲除载体的构建 1.连接反应体系：T4 DNA 连接酶 5U EcoRV 5U 线性化载体 2 l 稀释 100 倍后双链寡核苷酸 1 l 10连接酶 Buffer 1 l 50%PEG4000 1 l 加水补足 10 l 反应条件：22 30 min，37 15 min。注：1）平末端连接效率较低，在连接体系中添加 PEG4000 可以提高连接效率。2）在连接体系中添加 EcoRV 酶可以显着提高效率。2.转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 PCR 鉴定阳性克隆，挑选阳性克隆进行测序验证。解螺旋 http:/ 测序正确的阳性质粒，抽提质粒进行目标细胞（也可以先用 293T 细胞）进行转染试验,收取样品可以提取 DNA，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是sgRNA 有效，如果没有则该 sgRNA 无效。质粒不好转染的话，可以包装成慢病毒（前提是要构建慢病毒 Cas 载体）或者腺病毒。4.5.4.5.单克隆筛选单克隆筛选 （CRISPR/Cas9 的效率比较低，转染后还需要进行单克隆筛选才能获得阳性细胞群）1.将转染了质粒（或病毒感染好的细胞）消化，制备成细胞悬液，细胞计数；2.稀释细胞至合适浓度（如 1000 个/ml），取大概 50-60 个（1000 个/ml 时，取 50-60l），补培养基至 10ml，混匀，再以 100l/孔接种到 96 孔板，这时，约有不到一半的孔里有且仅有 1 个细胞；在细胞铁壁后，显微镜下观察，记录下单个细胞的孔；3.继续培养，待单细胞增殖至一定程度，可将细胞消化，分别移至 24 孔板，然后是 12 孔解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 4 板、6 孔板等（逐步放大），即可获得单克隆细胞群。4.获得的多个单克隆细胞群，分别抽提 RNA 进行测序鉴定，即可获得阳性单克隆细胞群。解螺旋 http:/ 1-3 3 1.Liao Y,Chen L,Feng Y,et al.Targeting programmed cell death ligand 1 by CRISPR/Cas9 in osteosarcoma cells.Oncotarget 2017;8 8(18):30276-87.2.Zhen S,Hua L,Liu YH,et al.Inhibition of long non-coding RNA UCA1 by CRISPR/Cas9 attenuated malignant phenotypes of bladder cancer.Oncotarget 2017;8 8(6):9634-46.3.Wu W,Duan Y,Ma G,et al.AAV-CRISPR/Cas9-Mediated Depletion of VEGFR2 Blocks Angiogenesis In Vitro.Invest Ophthalmol Vis Sci 2017;5858(14):6082-90.