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胶原及其促创面修复作用的研究吴志谷,耿淼,黎君友(解放军 304 医院 烧伤研究所基础部,北京 100037)摘要:本文介绍了牛胶原和猪真皮胶原制备方法、生物学特点以及动物移植的初步效果。结果表明胶原制备简便易行,氨基酸含量丰富,动物移植胶原材料效果肯定。提示胶原是创伤修复材料的理想天然生物资源。关键词:胶原;氨基酸;移植;创伤修复材料;生物资源中图分类号:R622 文献标识码:A 文章编号:1006-8376(2002)02-0049-04 真皮是皮肤组织修复工程中不可缺少的最重要的材料之一,真皮的主要成分是胶原,而胶原中含有大量的氨基酸,在大面积创伤及烧伤治疗中越来越引起人们的关注。大面积烧伤移植刃厚皮能及时封闭创面、减少感染、防止大量体液丢失,为创面康复提供了良好的条件。然而该皮缺乏足够的真皮,皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性明显降低,创面挛缩性瘢痕增生,严重影响愈后功能。为了克服这一难题,近 20 年人们对真皮替代物,特别是以胶原为基材的异种皮肤替代物进行了大量研究 1。本研究仅报告牛腱胶原和猪皮胶原氨基酸以及几种胶原创伤材料的制作和动物移植应用效果。1 材料和方法1.1 胶原提取1.1.1 牛胶原的提取新鲜成年冷冻牛腱切成 0.5 mm 左右的薄片,放入 0.05M 乙酸中(pH3.2),使其最终浓度为 1.5 2.5%(W/V)胶原-乙酸溶液,置 4 e 冰箱 4872 h。将膨胀的胶原倒入组织捣碎机中(1500 r/min)开 30 秒停 30 秒,重复 4 5 次,用 80 100#尼龙网过滤去除胶原溶液中残存有少许膨胀不佳的胶原颗粒。在捣碎和过滤胶原期间,空气会混入胶原液内形成大小不等的气泡,胶原液倒入抽滤瓶中直接抽气(真空泵)或倒入烧杯内置真空干燥箱内减压脱泡,即成均匀的胶原溶液 2。1.1.2 鼠尾胶原的提取按照鄂征5组织培养技术6鼠尾胶原的制备方法收稿日期:2001-09-05作者简介:吴志谷(1948-),男,副主任技师,主要从事创伤修复及其材料的研究提取3。1.2 牛胶原海绵的制备在胶原溶液中入加硫酸软骨素(成都制药三厂),将硫酸软骨素溶于 0.05M 乙酸内,缓慢加入并以 1000 r/min 速度不断的搅拌,使硫酸软骨素为胶原总量的 8%。将胶原液倒入模具内,在-30 e 左右的冰箱内预冻 4 h 以上。真空干燥 12 24 h,加热至 105e,恒温 24 h 即成为胶原海绵,放入 0.25%戊二醛溶液内,置 4e 冰箱交联处理 24 h 后,用滤过自来水漂洗 2 h,然后在双蒸水再置24 h(4 e),真空干燥保存或与聚氨酯粘附形成聚氨酯-胶原海绵复合膜2。1.3 去细胞猪真皮的制备中国五指山小型猪(中国农业科学院畜牧研究所提供)。体重 30kg,取胸背皮肤,用鼓式取皮机制成中厚皮片(0.6 0.8mm),在 0.2%胰蛋白酶溶液中处理 48h(4 e),T ritonX-100 处理 24 h(室温)制成无细胞猪真皮,置-30?2e 冰箱保存备用 4,5。1.4 理化测试牛腱胶原的氨基酸含量用日立 835-50 型氨基酸分析仪和紫外吸收光谱(Du-7 Beckman)测定,光电镜观察胶原海绵和猪真皮的结构特点。1.5 动物创面移植1.5.1 胶原海绵移植Wistar 鼠在 2%戊巴比妥钠在腹腔注射全身麻醉下,背部剃毛,常规消毒,先在背部手术区切取刃厚自体移植皮,然后切除全层皮肤达深筋膜(4 mm 4 mm),小邮票自体皮植入创面,覆盖聚氨酯-胶原海绵复合膜,包扎固定,单笼饲养。1.5.2 无细胞真皮移植中国五指山小型猪在全身麻醉下,背部剃毛,常规消毒,3%凝固汽油烧伤(度),切除全层皮肤达#49#氨基酸和生物资源Amino Acids&Biotic Resources 2002,24(2):49 52深筋膜(7cm 7cm)。使用前冻干无细胞猪真皮在无菌盐水中浸泡 30min,打孔并移植到创面上,间断缝合固定,同时在真皮上立即移植小块自体皮,然后用纱布敷料包扎。2 结果2.1 胶原吸收光谱及氨基酸分析牛腱胶原在紫外分光光度计上最大吸收峰值为223 nm 处,表明乙酸水解的牛腱胶原中的主要成份为氨基酸(图 1)。从表 1 的氨基酸谱中可以看到牛腱胶原中 18 种氨基含量情况,甘氨酸最高,约占氨基酸总量的 25.44%,其次是脯氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸和天门冬氨酸。表 2 显示三种动物胶原氨基酸谱,猪皮胶原氨基酸谱与牛腱胶原氨基酸谱和鼠尾胶原氨基酸谱相差较大,但牛腱胶原氨基酸谱和鼠尾胶原氨基酸谱比较相似。但三种动物胶原中氨基酸含量都很丰富,甘氨酸以鼠尾胶原最高,牛腱胶原次之,猪皮最低。2.2 胶原海绵真皮的组织学结构上述方法冷冻干燥的牛腱胶原都能获得较好的海绵结构,有大量的孔洞,其孔径为 50 400Lm 不等(图 2)。2.3 去细胞猪皮真皮经 0.2%胰蛋白酶和 T ritonX-100 处理后,猪皮上表皮和真皮中所有细胞均被清除,保持良好的胶原结构(图 3)图 1 牛腱胶原氨基酸谱表 1 新鲜冷冻牛腱胶原蛋白氨基酸含量的分布氨基酸名称含量/(Lg/mg)*百分率/%天门冬氨酸46.196.82苏氨酸15.772.33丝氨酸15.52.29谷氨酸77.6311.46甘氨酸169.0824.97丙氨酸6.340.94胱氨酸3.050.45缬氨酸21.173.20蛋氨酸8.291.22异亮氨酸12.771.89亮氨酸26.383.89酪氨酸10.291.52苯丙氨酸18.352.71赖氨酸21.913.23组氨酸5.530.82精氨酸60.999.01羟脯氨酸50.487.45脯氨酸94.4913.95共计677.25100.00表 2 几种动物胶原氨基酸谱的比较(%)氨基酸名称猪*牛腱鼠尾丙氨酸6.01216.0甘氨酸14.734.842.2缬氨酸1.95.53.7苏氨酸1.22.12.7丝氨酸2.93.72.9亮氨酸2.23.73.7异亮氨酸0.93.61.7脯氨酸12.613.02.4羟脯氨酸12.1)甲氨酸0.6)天门冬氨酸6.35.66.4苯丙氨酸2.43.32.0谷氨酸9.88.19.5胱氨酸)0.5赖氨酸14.94.24.1蛋氨酸)1.0羟氨酸1.6)酪氨酸0.5)0.6精氨酸8.9)组氨酸0.6)*中国人民解放军南京军区总医院汇编.二号人工皮简介.二号人工皮临床资料,1975;p4#50#吴志谷,等.胶原及其促创面修复作用的研究#51#氨基酸和生物资源3 讨论3.1 牛胶原氨基酸谱从牛腱胶原溶液的紫外吸收光谱可以看到,吸收最高蜂位于 223 nm,这表明胶原中含有大量的氨基酸。我们对三种动物胶原的氨基酸测定发现其氨基酸谱尽管有不少相似之处,但各成份含量存在很大差别。三者甘氨酸含量都很丰富,以鼠尾胶原为最多,牛腱胶原次之,猪皮胶原相对较少。猪皮的赖氨酸,脯氨酸和羟脯氨酸也很多;牛腱的脯氨酸和丙氨酸也很丰富;而鼠的丙氨酸极其丰富,仅次于牛腱胶原和猪皮胶原的甘氨酸和赖氨酸。尽管胶原中各种氨基酸含量的多寡对创伤修复作用的影响还不十分清楚,但研究表明含大量氨基酸的胶原生物材料对创伤组织和细胞再生提供了必要的良好条件。目前已有大量的猪皮或猪皮胶原材料用于创伤、烧伤创面,也有大量的牛腱胶原材料用于各种创伤的修复。鼠尾胶原尽量不会大量用作创伤修复材料,但由于鼠尾胶原纯度高和提取简便容易,至今它仍是体外培养一些组织或细胞的良好基质材料。3.2 胶原的制备根据胶原材料不同用途,制备胶原的方式和方法各异。目前使用胶原大致有三种方式:(1)天然胶原真皮,如去细胞牛或猪真皮;(2)再建胶原海绵(膜),即从牛、猪等动物组织中提取胶原,经加工处理制成胶原膜或胶原海绵,这种材料可做成各种创伤修复材料,皮肤真皮替代物,复合人工皮,和(3)胶原粉膜,作为制作各种修复材料的原材料。本实验制备牛腱胶原方法简便易行、冷冻干燥胶原海绵有良好的孔洞结构和生物学特性。所制备的去细胞猪真皮,皮内细胞清除干净,而胶原结构保存良好。3.3 胶原材料在创伤修复中的应用胶原海绵和胶原海绵复合材料可以作为真皮替代品植入皮肤缺损创面,或作为皮肤缺损创面的覆盖材料或植皮创面的覆盖材料。目前,最有代表性的 Integra 人工皮就是一种很好的皮肤替代品,而且是一种较理想的真皮替代品。这种材料内层是2mm 厚的从牛组织提取的胶原纤维与硫酸软骨素(glycosaminoglycan chondroitin-6-sulfate)结合的膜。外层是 0.0035 mm(0.009 英寸)聚硅氧烷(polysiloxane)模,具有类似正常上皮细胞水蒸汽传送特性的膜面。这种材料已在新鲜切除全层皮肤烧伤的创面的治疗、烧伤后疤痕挛缩治疗中都发挥着重要作用6。我们研制的胶原和聚氨酯复合人工皮在动物移植实验中也证明了这一点。用胶原材料作创伤修复材料的内层,或作为真皮材料替代物有明显促进创伤修复的作用。3.4 去细胞真皮近年来去细胞真皮越来越受到人们的重视。Wainwright 等已经设计了冷冻异体真皮与刃厚自体上皮结合的皮肤,AlloDerm(LifeCell Corporation,Woodlands,TX)已在市场上销售7。在尸体捐献者身上取适合的异体移植皮,用高渗盐溶液去除移植皮的上皮细胞成分,然后用去污剂(detergent)处理组织,以灭活任何病毒并冷冻干燥。这样处理过的皮肤从理论上讲是没有抗原的完整的真皮支架和基膜蛋白,包括粘连蛋白和 IV 及 VII 胶原类型。应用之前在盐水中再水合即可应用,它与超薄上皮自体移植皮联合应用封闭早期的创面。这种材料在严重烧伤和烧伤后再建的临床经验来看仍然是初步的和有限的,但是有益的。将异体人角化细胞放在无细胞猪真皮上培养的复合材料,异体表皮细胞能暂时粘附封闭切痂创面,同时促进残存创面的上皮化,固能达到确切的封闭效果8。在真皮替代品中加入大量自体成纤维细胞预培养 10 天,再移植到全层皮肤缺损创面能改善组织重建和调节疤痕组织的形成。本实验在小型猪烧伤切痂创面上移植去细胞真皮并立即移植自体皮是非常成功的,证明去细胞真皮与受体创面及自体皮均没有明显的排斥反应,真皮移植 10 天左右可达到完全血管化,自体皮在真皮上成活生长良好。上述结果证明不管是去细胞异体真皮还是去细胞异种真皮在全层皮肤缺损创面修复中都是真皮的理想替代品。参考文献:1 Sheridan RL and Tompkins RG.Skin substutites in burnJ.Burns 99;25:97 103.2 吴志谷,盛志勇,孙同柱,耿 淼,周宝桐,黎君友,黄祖秀.几种胶原型烧创伤修复材料制作的实验研究 J.生物医学工程学杂志,2000;16(2):147.3 鄂征.组织培养技术(第二版)M.人民卫生出版社,1993,63 64.4 吴志谷,耿淼,盛志勇.无细胞猪真皮植入鼠皮下组织形态学的观察J.军医进修学院学报,1999;20(4):277.5 吴志谷,耿淼,盛志勇.猪真皮与自体皮在鼠缺损创面的移植J.军医进修学院学报,2001;22(1):62.6 Kim BM,Suzuki S,Nishimura Y,et al.Cellular artificialskin substitute produced by short period simultaneous cu-lture of fibroblasts and keratinocytes J.Br J Plast Surg1999;52(7):573 8.7 Suzuki S.Artificial dermis J.Nippon Geka Gakkai#52#吴志谷,等.胶原及其促创面修复作用的研究谷氨酰胺防治辐射损伤的作用刘 颖,金 宏(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津 300050)摘要:综述了谷氨酰胺(Gln)对辐射损伤的防护作用。重点介绍了 Gln 对辐射引起的肠道损伤、免疫功能和细胞损伤的防护作用,并介绍了 Gln 在肿瘤放射中的作用。关键词:谷氨酰胺;辐射;损伤中图分类号:R818 文献标识码:A 文章编号:1006-8376(2002)02-0053-03 谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是体内游离氨基酸池中含量最丰富的氨基酸,健康人血浆 Gln 浓度接近于 1 mmol/L,而且其周转率非常快,每小时的周转量为 318 373 Lmol/kg 体重(1)。Gln 与葡萄糖一样是一种高效的能源物质,主要作为快速生长和分化细胞如血管内皮细胞、淋巴细胞、肠粘膜上皮细胞等的燃料;Gln 也是嘌呤、嘧啶、某些氨基酸、蛋白质、核酸等生物分子合成的重要前体。Gln 过去一直被认为是非必需氨基酸,随着肠外及肠内营养的发展,大量的动物实验及临床研究证实 Gln 在肠外及肠内营养中具有独特的代谢效应和营养作用,所以现在被认为是半必需氨基酸或条件必需氨基酸(conditional essential aminoacid)。近年来 Gln 对辐射的防护作用引起了人们越来越多的关注。收稿日期:2001-09-26作者简介:刘颖(1973-),女,硕士研究生。现工作单位:内蒙古医学院基础部卫生学教研室,100059)1 Gln 对辐射肠道损伤的防护作用:胃肠道上皮是对辐射敏感的组织,辐射可造成肠道急性和慢性损伤。辐射造成肠粘膜急性炎症即放射性肠炎,在光镜下可见绒毛变短变平,肠腺隐窝细胞有丝分裂减少,隐窝高度降低。肠道慢性损伤常见血管透明样变,并伴有/放射性成纤维细胞0的形成。放疗可使小肠上皮细胞凋亡增加,以及隐窝细胞不断向绒毛顶部迁移而隐窝底物缺乏足够的代偿性细胞分裂活动(2),从而导致肠道的屏障功能障碍,肠道内菌落和肠腔内有毒分解产物等炎性介质不断进入血液和淋巴,形成瀑布样反应,从而引起肠源性败血症,甚至多器官功能衰竭。Gln 是小肠最重要的能源物质,而小肠也是 Gln代谢的主要部位。正常生理状态下,肠道所需的Gln 来源于体内的合成,而在疾病和各种应激刺激下机体对 Gln 的消耗增加,合成不能满足需要,会导致 Gln 缺乏,影响肠道的功能,所以充足的 Gln 作为小肠代谢底物是小肠保持正常功能的重要条件之一。研究发现,大鼠腹部一次性照射 10 Gy 后,在其 Zasshi 1999 Sep;100(9):534 8.8 Konigova R,Matouskova EL,Broz.Burnwound coverage and burn wound closure J.Acta Chir Plast 2000;42(2):64 8.Study on Collagen and Its Effect on Promoting Wound RepairWU Zhi-gu,GENG Miao,LI Jun-you(Burn Institute,304th Hospital of PLA,Beijing 100037)Abstract:The method of preparing bovine collagen and pig dermal collagen,biological characteristics andthe primary effect of two collagenswas investigated by transplanting them into Wistar rats.The results indicatedthat the collagens were prepared easily,and contained rich amino acids and had positive effect on the transplan-tation.The study showed that the collagens were the ideal and natural biotic resources for wound repair.Key words:collagen;amino acid;transplantation;wound repair#53#氨基酸和生物资源Amino Acids&Biotic Resources 2002,24(2):53 55