shRNA慢病毒载体构建(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 shRNAshRNA 慢病毒载体构建慢病毒载体构建 RNAi 实验技术的视频介绍，请见解螺旋在线视频课程酸谈实验室之基因表达操作篇：RNAi 1.1.实验原理实验原理 RNA 干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。siRNA 可与细胞质中特定的酶形成 RNA 诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC），siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶是该复合体中的必备成分。在 RISC 的作用下，siRNA 解链成为单链，由其中的反义链特异识别目的 mRNA 并与之结合。一经结合，细胞内的核酸内切酶就在靶 mRNA 的近中点位置切害 目的 mRNA,被切害 的 mRNA片段被核酸外切酶降解后无法正常编码成相应的蛋白质，从而导致功能缺失。RNAi 作为一种重要的基因转录后沉默机制，广泛应用于基因功能研究，肿瘤及病毒感染性疾病治疗的实验研究。目前主要有 siRNA 转染和构建 shRNA（慢病毒）表达载体两种技术。前者通过合成靶向目标基因的 siRNA 序列（19-27bp），然后将 siRNA 序列转染到细胞里。后者是通过将 siRNA 转化为 shRNA（编码 siRNA 正义链和反义链，并且之间由一段 loop 序列隔开），然后将化学合成的 shRNA 插入到载体中，载体可通过转染进入细胞，或者包装成慢病毒，由慢病毒感染细胞（从而把 shRNA 带入细胞）。本方案介绍 shRNA 慢病毒载体的构建。慢病毒包装、慢病毒感染请见 解螺旋 http:/ 陪伴医生科研成长 http:/ 2 2.2.实验目实验目的的 构建含有针对目的基因的 shRNA 骨架质粒并包装成慢病毒，感染细胞。解螺旋 http:/ 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 试剂名称试剂名称 试剂来源试剂来源 C Cat.No.at.No.DNA oligo GENEWIZ Biomiga Plasmid Kit BIOMIGA PD1220-02 BamHI-HF NEB EcoRI-HF NEB LB 培养基/LB 琼脂培养基 BBI SD7002/SD7003 CaCL2 BBI CT1330-500g T4 DNA ligase NEB M0202L 琼脂糖 N BBI AB1004 DNA Marker TIANGEN 测序 GENEWIZ 3.2.3.2.主要仪器主要仪器 仪器名称仪器名称 仪器来源仪器来源 Cat.No.Cat.No.稳压电泳仪 Tanon EPS-300 凝胶成像仪 Tanon Tanon1600 细菌摇床 世平实验设备公司 SPH100D 生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司 SHP080 PCR 仪 BIOER TC-96/G/H(b)A 高速离心机 Thermo MicroT7R 60mm 细菌培养皿 海门市蓝天生物实验器材厂 1.5ml 离心管 海门市蓝天生物实验器材厂 10 ml 离心管 海门市蓝天生物实验器材厂 4.4.实验步骤实验步骤 4 4.1.1 shRNAshRNA 慢病毒载体构建慢病毒载体构建 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 3 4 4.1.1.1.1 s siRNAiRNA 序列序列 设计 shRNA 序列并于美国国立生物技术信息中心 NCBI(The National Center for Biotechnology Information)网站：http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/对该条靶点 siRNA序列进行分析，Blast 检索确定该序列的有效性。4 4.1.1.2 2 骨架质粒骨架质粒 DNADNA 慢病毒载体质粒有很多商业化的载体可以使用。解螺旋 http:/ 3 感受态细菌制备感受态细菌制备 1.配制下述溶液 1)0.1M CaCl2溶液，以 0.22 过滤除菌;2)250mM KCl 溶液；3)2M MgCl2溶液，高压灭菌；4)SOB:1 ml 250mM KCl 溶液加入 100 ml LB，以 5 M NaOH 调 PH 值至 7.0，高压灭菌，临用前加入 0.5 ml 2 M MgCl2溶液；2.用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞步骤：1)从于 37培养 16 小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有 100 ml LB 或 SOB培养基的 500 ml 烧瓶中。于 37，250rpm 培养 3 小时。2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置 10 分钟，使培养物冷却至 0。3)于 4,以 4000rpm 离心 10 分钟，回收细胞。4)倒出培养液，将管倒置 1 分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。5)以 10 ml 用冰预冷的 CaCl2溶液重悬沉淀，放置于冰浴上。6)于 4，以 4000rpm 离心 10min，回收细胞。7)倒出培养液，将管倒置 1 分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。8)每 50 ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。9)将细胞分装成小份，放于-80冻存。4.4.1.1.4 4 克隆制备：克隆制备：1.连接 连接反应体系:解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 4 于 25连接 2h。2.转化(1)配制下述溶液 1)250mM KCl 溶液 2)2M MgCl2溶液，高压灭菌；3)LB 培养基:1ml 250mM KCl 溶液加入 100 ml LB，以 5M NaOH 调 PH 值至 7.0，高压灭菌，临用前加入 0.5ml 2M MgCl2溶液；4)LB 琼脂培养基：称量 4g 粉末溶于 100 ml 超纯水中，搅拌溶解，高压蒸汽灭菌，冷至温度低于 60，加入 Amp 至终浓度到 100 g/ml，混匀铺板，一般 60mm 平皿需要 5 ml 培养基；5)1M 葡萄糖溶液，过滤除菌；解螺旋 http:/ 培养基：2 ml 1M 葡萄糖溶液加入 100ml SOB 培养基；(2)转化实验步骤：（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版 55-56 页）1)用无菌吸头取 50 l 感受态细胞悬液到无菌的微量离心管中，每管加 5 l 连接液，轻轻旋转以混匀，在冰中放置 30 分钟。2)水浴锅预热到 42，热激 90 秒。3)快速将管转移到冰浴中，冷却 2 分钟。4)每管加 800 l 无抗性 LB 培养基，然后将管转移到 37摇床上，温育 45 分钟复苏。5)6000g 离心 2min，用 100l LB 重悬已转化的感受态细胞，然后转移到含 Amp 抗性（100ug/ml）的 LB 琼脂培养基上。6)将平板置于室温直至液体被吸收。3.阳性克隆的 PCR 鉴定 1)菌落 PCR 反应体系：试剂 体积（ul）Primer（F）0.5 试剂 阳性对照(l)自连对照(l)连接组(l)线性化的载体 DNA 100ng/l 1 1 1 退火的双链 DNA 100 ng/l 1-1 10 T4 DNA 连接酶缓冲液 1 1 1 T4 DNA 连接酶 1 1 1 dd H2O 补足 10 补足 10 补足 10 解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 5 Primer（R）0.5 2PCR mix 10 菌落 少量 ddH2O 补足 20 2)PCR 反应，按以下循环条件：94 2 min 94 30 sec 55 30 sec 25 cycle 72 30 sec 72 5 min 菌落 PCR 模版：在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，点到 PCR 管底；阴性对照：排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；3)测序。挑选 1-2 个阳性克隆，进行测序，确认序列是否正确。解螺旋 http:/ 5.应用示例应用示例文献文献1 1 1.Liu AQ,Ge LY,Lu XL,et al.Silencing of the hTERT gene by shRNA inhibits colon cancer SW480 cell growth in vitro and in vivo.PLoS One 2014;9 9(9):e107019.