丁香园——常用原代细胞培养方案.pdf

丁香园常用原代细胞培养方案 丁香园细胞技术讨论版 zhaoqingshan、victoh、midas、Goodluck_XD、drake015 丁香园常用原代细胞培养方案 丁香园细胞技术讨论版 zhaoqingshan、victoh、midas、Goodluck_XD、drake015 整理 2005 年 第一版 版权说明 版权说明 本电子图书由丁香园细胞技术讨论版制作出品。版权所有，保留一切权利。在没有得到版权所有人授权的情况下，任何单位和个人不得擅自复制本书中的一部分或全部，也不得以任何形式(包括资料和出版物)进行传播。版权所有，侵权必究。内容如有改动，恕不另行通知。丁香园细胞技术讨论版：http:/ 序言 序言 酝酿 2 个月之久的丁香园常用原代细胞培养方案终于出炉了，在此，我们衷心地感谢丁香园战友对这项工作的参与和支持！也衷心地感谢丁香园管理阶层的领导们对细胞技术讨论版的关心和帮助！组织细胞培养技术，深入生物医学的每一个角落，其背景知识，实是渊深海阔，涉及的相关领域很多，如：组织学、胚胎学、解剖学、生理学、病理学等等；而作为研究手段和方法，组织细胞培养技术被广泛地应用于生物医学的各个领域，如：细胞生物学、微生物学、免疫学、肿瘤学、发育学以及临床医学等等。因此，组织细胞培养技术是从事生物医学的研究人员应熟悉和掌握的基本技术。古训“博观而约取，厚积而薄发”，又曰“胸中有万卷书，笔底无半点尘者，始可著书”，古人治学态度之严谨令我们叹服！尽管如此，我们不揣鄙陋，整理了这份常用原代细胞培养方案稿件，希望战友们学习的过程中能取精去粕，扬长避短，从中能有所领会和收获，而贡献于祖国的医药生物学事业，那么我们的辛苦也是值得的！当然，因为时间仓促，而我们的知识和精力也是很有限的，文中肯定有很多疏漏之处，希望战友们批评指正！我们将予以修改和整理后，继续发表丁香园常用原代细胞培养方案第二版！本文为丁香园电子文集，版权归丁香园网站所有，凡是不告而转载者，均以侵权追究！谨以此文献给我们亲爱的丁香园网站！献给我们热爱的并为之奋斗过的细胞技术讨论版！献给我们可爱的丁香园战友！丁香园细胞技术讨论版全体版主：zhaoqingshan、victoh、midas、Goodluck_XD、drake015 2005 年 1 月 10 日 丁香园细胞技术讨论版电子文集 目录 目 录 目 录 目 录目 录.1.1 前 言前 言.3.3 第一章 成纤维细胞培养第一章 成纤维细胞培养.4.4 第一节 小鼠胚胎成纤维细胞培养.5 第二节 大鼠肺成纤维细胞培养.7 第二章 内皮细胞培养第二章 内皮细胞培养.9.9 第一节 大鼠脑微血管内皮细胞培养(之一).10 第二节 大鼠脑微血管内皮细胞培养(之二).17 第三节 人脐静脉内皮细胞培养.19 第四节 大鼠主动脉内皮细胞培养.21 第三章 肌细胞的培养第三章 肌细胞的培养.23.23 第一节 新生大鼠心肌细胞培养.23 第二节 兔膀胱平滑肌细胞培养.27 第三节 人脐动脉平滑肌细胞培养(消化法).31 第四节 人脐动脉平滑肌细胞培养(贴块法).32 第五节 大鼠主动脉平滑肌细胞培养(贴块法).33 第六节 动脉粥样硬化患者血管平滑肌细胞培养.34 第四章 骨类细胞培养第四章 骨类细胞培养.35.35 第一节 大鼠乳鼠成骨细胞培养.35-1-丁香园细胞技术讨论版电子文集 目录 第二节 乳兔软骨细胞培养.38 第三节 家兔椎间盘细胞培养.39 第五章 神经外胚层细胞培养第五章 神经外胚层细胞培养.41.41 第一节 大鼠大脑皮层神经元细胞培养.41 第二节 神经胶质细胞培养.43 第三节 大鼠星型胶质细胞培养.45 第四节 大鼠视神经少突胶质细胞培养.48 第六章 上皮细胞培养第六章 上皮细胞培养.53.53 第一节 小鼠肝细胞培养.53 第二节 大鼠胰岛细胞培养.55 第三节 猪甲状腺细胞培养.56 第七章 其它类别的细胞培养第七章 其它类别的细胞培养.58.58 第一节 大鼠肝星状细胞培养.58 第二节 人滑膜细胞培养.60 第三节 小鼠腹腔巨噬细胞培养.62 附录附录.63.63 -2-丁香园细胞技术讨论版电子文集 前言 前 言 前 言 原代培养是从供体中取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的细胞具有很多特点，首先组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使生长出同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对细胞进行短期传代后进行(需要注意的是，正如前面已提到的，有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化)。一般，常采用 2-5 代的细胞进行实验。当然，特殊情况和一些终末细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。此外，原代细胞培养还需要做各种鉴定，如普通的形态学鉴定、表达蛋白质分子的免疫组织化学鉴定、生化鉴定以及电镜的鉴定等。原代培养的方法很多，最基本和最常用的有两种，即组织块法和消化法。这些方法，我们将在后面的各个章节分别介绍。做好原代细胞培养需注意的事项很多：严格的无菌操作是成功的首要条件；选择合适取材组织、挑选合适的操作方案、操作手法的规范等等，都将影响到实验的成功与否。以下，我们将要介绍一些常用原代细胞培养的方案，值得注意的是，这些方法都是来自丁香园中不同战友、不同实验室的方案，因为每个人、每个实验室可能会有不同的习惯和不同的经济情况，战友们采用这些方案(或者说引进这些方案)的时候，都必须根据个人的情况而加以选择，取其精华，去其糟粕！-3-丁香园细胞技术讨论版电子文集 第一章 成纤维细胞培养 第一章 成纤维细胞培养 第一章 成纤维细胞培养 成纤维细胞是来源于中胚层的细胞，很容易生长，一般不需要特殊条件，常规培养即可。原代成纤维细胞培养，一般说来可以分为消化法和贴块法。主要以消化法较为多用，一般用胰酶即可，只要注意不要消化过度，实验一般都可以成功。原代成纤维细胞贴块法培养和常规的贴块法相同。成纤维细胞对培养条件的要求不高，属于比较容易生长的细胞，培养液可以用DMEM或RPMI1640，血清则一般用10%的小牛血清就可以了。至于细胞纯化方面，一般的杂质细胞在传代过程中可以采用差速贴壁法(见本章第二节2.7)去除，也可以以自然纯化法纯化而获得较纯的成纤维细胞。目前已经有许多建立好的成纤维细胞系，可以传代50代左右。自己原代培养的成纤维细胞一般可以传10代左右，与各个实验室的条件和实验方法有关。常用的成纤维细胞培养有：胚胎成纤维细胞、胚肺成纤维细胞、肺成纤维细胞、心脏成纤维细胞的原代培养等。本章我们探讨其中的胚胎成纤维细胞和肺成纤维细胞的原代培养。-4-丁香园细胞技术讨论版电子文集 小鼠胚胎成纤维细胞培养 第一节 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养 第一节 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养 随风飘扬 1 材料材料 1.1 动物动物 孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。1.2 试剂试剂 无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。1.3 器械器械 眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。2 方法方法 2.1 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。2.2 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。2.3 用200 l的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。2.4 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。2.5 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3107细胞)。2.6 3106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。2.7 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。2.8 细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代。2.9 细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)1。3 结果结果-5-丁香园细胞技术讨论版电子文集 小鼠胚胎成纤维细胞培养 见下图：小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 100 倍)4 讨论讨论 4.1 原代培养，一定要避免污染。4.2 MEF 生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。4.3 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。4.4 消化细胞时间不要过长。参考文献参考文献 1 D.L.斯佩克特.细胞实验指南M.第一版.北京.科学出版社.2001:49-50.-6-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠肺成纤维细胞培养 第二节 大鼠肺成纤维细胞培养 第二节 大鼠肺成纤维细胞培养 zhaoqingshan 1 材料材料 1.1 动物动物 出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。1.2 试剂试剂 PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。1.3 器械器械 眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25cm2塑料培养瓶(Costar)。2 方法方法 2.1 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。2.2 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200 U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。2.3 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。2.4 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。2.5 用200 l微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 l加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。注意上述操作过程中动作要轻柔，让液体慢慢覆盖组织小块，严禁动作过快致使液体产生的冲力使粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。48 h后换液，更换2-3 ml即可。2.6 贴块贴壁72 h后，镜下可见大量的成纤维细胞爬出，将组织块去除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。2.7 传代用0.25%胰酶常规消化，以1:2传代，传代完后，采用差速贴壁法纯化一次，即待细胞贴壁1.0 1.5 h后(即绝大多数成纤维细胞都已经贴壁)，弃去未贴壁的细胞和培养液，更换新的培养液。-7-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠肺成纤维细胞培养 3 结果结果 成纤维细胞为长梭形形态，常呈漩涡状生长。见下图：40 倍 100 倍 200 倍 4 讨论讨论 一般来说，贴块培养法，只要不加一些选择性的添加物(血清浓度 10%，不加生长因子，不加肝素，不加地塞米松等)，最后成纤维细胞必然成为优势细胞，因为：巨噬细胞是终末细胞；内皮细胞较娇气；平滑肌细胞贴壁慢，也不容易爬出；肺上皮细胞会被血清抑制，增殖能力也很弱。所以，成纤维细胞是很容易培养的。-8-丁香园细胞技术讨论版电子文集 第二章 内皮细胞培养 第二章 内皮细胞培养 第二章 内皮细胞培养 血管内皮细胞(VEC)为衬贴于血管腔面的单层扁平上皮细胞，由中胚层成血管细胞分化而来，它沿着血管内壁单层有序排列，直接与血液的各种成分相接触，是血液、血流、血管三者相互联系的界面和环节。VEC厚薄不一，在大血管VEC的厚度为 1 m，在毛细血管和微静脉，其厚度为 0.1 m。VEC大小较一致，形态扁平，宽约 1015 m，长约 2550 m。VEC的数量很可观，据估计，成人约有 6x1013个VEC，净重约 1 kg1。1865 年，His首先提出内皮(endothelium)这一概念，长期以来以来人们对于VEC功能的认识仅限于它衬在血管内壁，为血流提供光滑的表面，并作为半透膜，将血管内外分开，起屏障作用。1980 年，Furchgott等2发现血管内皮舒张因子(EDRF)后，人们对内皮功能的认识逐渐深入。研究表明，内皮并非单纯起结构性屏障作用，而是具有多种生理功能，参与机体的血管调节、凝血、纤溶、免疫、物质转运和生物活性物质释放等生命活动。目前对内皮的看法是“内皮是一力学的、具有异质性的弥散性器官，它有活跃的分泌、合成、代谢以及免疫功能”3。此外，VEC 不仅存在种间异质性，也存在种内异质性。即同一个体的不同器官、组织的 VEC，其表型、功能各不相同，且与来源组织、器官的功能密切相关。内皮细胞属于比较娇气的细胞，较难培养，需要的培养条件比较高。一般血清含量不低于 20%(建立的细胞株除外)，条件允许的话，进口胎牛血清是首选的血清；培养基中往往需要添加生长因子，常用的促进内皮细胞增殖的生长因子有 ECGS、ECGF、VEGF、bFGF 和 EGF，在添加生长因子的同时，需要添加 100 U/ml 左右的肝素钠。常用的培养基有：DMEM、M199、RPMI1640、DMEM/F12。目前，内皮细胞原代培养所采用的方法有消化法、贴块法、过滤取微血管段法(严格说来，应该也归于组织块贴块一类)、磁珠偶联抗体分离法，不同方法的选择，与内皮种类不同、实验需要不同和各个实验室的习惯不同而相关。常见的内皮细胞培养有：脐静脉内皮细胞培养、主动脉内皮细胞培养、微血管内皮细胞培养，其中微血管内皮细胞培养目前成为内皮细胞培养中的热点问题之一，只是微血管内皮细胞更加娇气，分离困难，增加了培养的难度。以下我们将要探讨的是常见的人脐静脉内皮细胞、大鼠主动脉内皮细胞和大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养方法。1 成令忠,组织学M.第二版.北京:人民卫生出版社.1993:831.2 Furchgott RF,Zawadzki JV.The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine J.Nature,1980,288(5789):373-376.3 Fishman AP,Endothelium.A distributed organ of diverse capabilitiesJ.Ann NY Acad Sci,1982,401:1-8.-9-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 第一节 大鼠脑微血管内皮细胞培养(之一)第一节 大鼠脑微血管内皮细胞培养(之一)Endotheliums 脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的重要成分，与外周血管内皮细胞不同，它具有高跨内皮阻抗(transendothelial electrical resistance，TER)、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征，从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障1。由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的其体内固有的特点1，因此目前脑微血管内皮细胞体外培养模型已被广泛应用于血脑屏障的研究、脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究、新药筛选、脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究等领域。而大多数体内实验采用大鼠为动物模型，而且大鼠具有较多的细胞生物学研究所需的抗体可用，因此进行大鼠脑微血管内皮细胞的培养具有重要的意义。自从Panula等2首次成功培养大鼠脑微血管内皮细胞以来，国内外有关大鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养方法已有较多的报道，我们发现国内的方法多以组织匀浆、两次尼龙网过滤分离脑微血管段为主3,4，也有采用酶消化、梯度离心及尼龙网过滤的5，但细胞得率均较低，而近些年来国外大多数方法采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养6-9,11,12。由于原代培养中无法避免地混杂成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、星型胶质细胞等其他细胞的生长，而且工作量大、过程繁琐且费用高1，进行较纯的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养一直是国内外的一个难点。本人参照文献6-8的方法，成功地摸索出大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法，并获得纯度较高的脑微血管内皮细胞。1 材料材料 1.1 实验动物实验动物 每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重4060 g。1.2 试剂试剂 纤连蛋白(fibronectin)、型胶原、鼠尾胶、葡聚糖(dextran，分子量100200 kDa)和DNA酶I(DNase I)购自Sigma公司；D-Hanks液、10PBS按配方自制；II型胶原酶购自Worthington公司；明胶、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES购自Amresco公司；Percoll 购自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)购自GIBCO/BRL公司；肝素钠、NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司；青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司；-10-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 胎牛血清(FBS)购自PAA Laboratories；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胶原酶/分散酶(collagenase/dispase)购自Roche公司。1.3 仪器仪器 低温离心机(Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；Himac CR 22F，购自Hitachi)1.4 试剂配制试剂配制 1 mg/ml鼠尾胶(用0.2%乙酸配制)，1%明胶(用D-Hanks液配制)，1%II型胶原酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%的浓度)，1%胶原酶/分散酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20%BSA(用DMEM配制，调pH值至7.4后用0.45 m滤膜过滤除菌，较难过滤)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/l)，以上试剂经0.22 m滤膜过滤除菌后分装保存于-20；50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液,0.67 ml 10PBS,0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培养液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 g/ml)，pH值调至7.4，过滤除菌后分装保存于4，用时加入20%FBS及1 ng/ml bFGF。2 方法方法 2.1 培养皿预处理培养皿预处理 涂布3种不同的基质：培养前一天加入1 ml 1%明胶于35 mm塑料培养皿，置于37 培养箱过夜，接种前用D-Hanks液漂洗2次；接种前4 h，加入鼠尾胶610 g/cm2，在密闭的器皿里用氨气熏510 min后，置于室温12 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次；50 l 0.1%纤连蛋白、50 l 1 mg/ml 型胶原和400 l双蒸水混合后，加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出，可涂布10个培养皿，置于37 培养箱12 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次。2.2 脑微血管段的分离与脑微血管内皮细胞原代培养 脑微血管段的分离与脑微血管内皮细胞原代培养 大鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒35 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑(包括海马)，随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质，用D-Hanks液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%型胶原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑)混匀后37 水浴消化1.5 h，离心(1000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入20%BSA悬浮混匀后离心(1000 g，20 min，4)或加入15%葡聚糖悬浮混匀后离心(4000 rpm，20 min，4)，去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀，加入2 ml 0.1%胶原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)悬浮混匀后37 水浴消化1 h，离心(1000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50%Percoll(25000 g，60 min，4)，离心-11-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养(1000 g，10 min，4)，靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次(离心1000 rpm，5 min，室温)，去上清液，加入DMEM完全培养液(含20%FBS，100 g/ml肝素钠)悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿(1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑)，置于37、5%CO2培养箱内静置培养，1224 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。2.3 鉴定方法鉴定方法 形态学、因子相关抗原免疫组织化学检测。3 结果结果 3.1 细胞形态观察细胞形态观察 接种当时可见由圆形的内皮细胞构成的呈单枝状或分枝状的脑微血管段，并可见散在的单细胞及组织碎片(见图1-1)；培养1224 h后可见培养的细胞从贴壁的微血管段周围长出，细胞呈短梭形，区域性单层生长，经换液后微血管段的残余部分不断减少，成纤维细胞、周细胞等杂细胞含量较少；随着培养时间的延长，内皮细胞不断增殖，可见“漩涡”分布，大约57天细胞达到融合，短梭形的内皮细胞占90%以上，但可见少量周细胞等杂细胞生长于内皮细胞单层表面或细胞克隆间隙(结果未显示)。细胞生长过程见图1，细胞接种于纤连蛋白/型胶原涂布的培养皿。3.2 涂布不同基质的细胞生长情况涂布不同基质的细胞生长情况 明胶及鼠尾胶涂布的培养皿微血管段贴壁时间较长，6 h时可见少量微血管段贴壁但无内皮细胞长出，1224 h可见一些内皮细胞长出，24 h后脑微血管段完全贴壁并有较多的内皮细胞长出，两者无明显差异(见图2-14)；纤连蛋白/型胶原涂布的培养皿培养后6 h即可见微血管段贴壁并有一些内皮细胞长出，1224 h内基本完全贴壁并有较多的内皮细胞长出(见图2-5,6)。3.3 免疫组化鉴定免疫组化鉴定 因子相关抗原免疫组化检测可见培养的脑微血管内皮细胞的胞浆及核周有棕黄色着色，胞核呈空泡状结构；对照染色为阴性。4 讨论讨论 我们采用两次酶消化、梯度离心分离得到脑微血管段，探索各种不同的培养条件，成功地进行了较纯的大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养，内皮细胞纯度可达90%以上，而且细胞得率较高，10只动物可培养810个35 mm一次性塑料培养皿，培养面积大约80100 cm2，与国内的一些方法35相比，细胞得率有明显的提高。由于新生鼠易于混有较多的杂细胞且大脑较小以及哺乳期大鼠优于超过1月龄的大鼠9，我们采用23-12-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 周龄哺乳期的SD大鼠作为培养材料。脑微血管内皮细胞原代培养的关键是首先分离获得纯度较高且活力好的脑微血管段。在解剖过程中仔细去除软脑膜、大血管及大脑白质收集大脑皮质，可减少成纤维细胞和平滑肌细胞的生长，对于提高内皮细胞的纯度具有重要意义。由于胶原酶对内皮细胞的损伤较小，我们采用0.1%型胶原酶消化剪碎后的大脑皮质分散组织，同组织匀浆法3,10相比，酶消化法可避免组织匀浆对内皮细胞的损伤，从而有利于提高细胞的活力。经胶原酶消化后采用20%BSA或15%葡聚糖离心可分离脑微血管段与神经组织及大血管，得到底层的脑微血管段，这种方法被广泛应用于脑微血管段的分离59,11,12，我们发现20%BSA较15%葡聚糖而言，其分离获得的脑微血管段数量更多，而且脑微血管段状态更好更易贴壁生长。由于周细胞是脑微血管内皮细胞原代培养中最常见的杂细胞，它会明显抑制内皮细胞的生长7，因此原代培养中应尽量减少周细胞的数量，我们采用两次酶消化方法7，控制两次酶消化的时间，用0.1%胶原酶/消化酶分散出内皮细胞外围的周细胞，最后采用一定浓度的连续梯度的Percoll分离以去除周细胞和红细胞得到较纯的脑微血管段。在酶消化过程中加入适量的DNA酶可分散消化过程中释放的DNA所引起的微血管段凝结块，有利于增加微血管段的得率。对于Percoll离心，我们尝试了3个浓度(33%、45%及50%)后发现，浓度越大，脑微血管段离靠近离心管底的红细胞及周细胞越远，分离效果也越好，因此采用50%Percoll效果最好，并且最好采用水平转头的低温离心机以提高离心效果。内皮细胞纯化的其他方法有机械刮除法、克隆培养法、FACS分类法13、Thy1.1免疫反应杀伤法7,14、采用血浆来源的胎牛血清8、磁珠结合法10等，但是我们发现机械刮除法和克隆培养法并不适合大鼠脑微血管内皮细胞的纯化，因为原代内皮细胞传代后状态不佳且易被杂细胞所抑制7，而后面几种方法比较昂贵不予推荐；血浆来源的胎牛血清不含PDGF，不促进杂细胞的生长，但是其较昂贵，可选择胎牛血清用于原代培养。脑微血管内皮细胞的原代培养需要涂布明胶、鼠尾胶、纤连蛋白等基质以利于脑微血管段贴壁和内皮细胞的生长。我们尝试不同基质后发现其对脑微血管段的贴壁和内皮细胞的生长作用不同，纤连蛋白/IV型胶原优于鼠尾胶，而鼠尾胶比明胶好，而且接种密度的要求前者比后两者要低，后两者需要达到一定密度才有利于脑微血管段贴壁。另外我们发现内皮细胞不易生长于玻片上，而较易生长于塑料培养皿上，这与文献报道基本相符8,14。内皮细胞生长需要添加内皮细胞生长因子以促进内皮细胞的增殖抑制杂细胞的生长，我们采用bFGF可有效促进内皮细胞的生长，同时添加100 g/ml肝素协同bFGF的作用并可抑制平滑肌细胞的生长9。同时为了保证内皮细胞的营养，并去除脑微血管段的残余碎片，我们采用20%FBS的血清浓度并隔天换液。我们培养的脑微血管内皮细胞呈短梭形，区域性单层生长，随着培养时间的延长及内皮细胞的增殖，可见“漩涡状”分布，约57天后，各区域之间可逐渐融合，其形态和生长特点与大多数文献报道相似69,11,12。根据内皮细胞的短梭形的形态特点、因子相关抗原表达阳性可鉴定我们所培养的细胞确为脑微血管内皮细胞3,5,8。-13-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 我们的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养模型的建立，对于研究脑内皮的生理、生化及药理研究是一个较好的工具，同时可与星型胶质细胞共培养用于构建血脑屏障模型1。相信随着技术方法的不断改进，脑微血管内皮细胞体外培养的模型将逐渐接近于其在体特征，并被广泛应用于相关研究1。参考文献参考文献 1 Grant GA et al.News Physiol Sci,1998,13：287 2 Panula P et al.Experientia,1978,34：95 3 王建民等。解剖学杂志，1998，21：495 4 许彦钢等。微循环技术杂志，1997，2：63 5 钱志远等。细胞生物学杂志，1999，21：42 6 Kis B et al.Neuroreport,2001,12：4139 7 Szabo CA et al.Neurobiology(Bp),1997,5：1 8 Abbott NJ et al.J Cell Sci,1992,103：23 9 Gordon EL et al.In Vitro Cell Dev Biol,1991,27A：312 10 Diglio CA et al.Lab Invest,1982,46：554 11 Rupnick MA et al.In Vitro Cell Dev Biol,1988,24：435 12 Ichikawa N et al.J Pharmacol Toxicol Methods,1996,36：45 13 Scott PA et al.J Cell Sci,1993,105：269 14 Domotor E et al.Neurochem Int,1998,33：473-14-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 图图1 大鼠脑微血管内皮细胞原代培养过程中的生长与形态变化大鼠脑微血管内皮细胞原代培养过程中的生长与形态变化 1.接种后当时，可见单枝状及多枝状脑微血管段，100；2.培养12 h后，可见内皮细胞从贴壁的微血管段游离长出，100；3.培养第4天，细胞不断增殖，呈短梭形，单层生长，40；4.培养第4天，细胞不断增殖，呈短梭形，单层生长，100；5.培养第7天，细胞单层达到融合，可见“旋涡状”分布，40；6.培养第7天，细胞单层达到融合，可见“旋涡状”分布，100。-15-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 图图2 三种不同基质下内皮细胞的贴壁及生长情况三种不同基质下内皮细胞的贴壁及生长情况 1.1%明胶涂布的培养皿接种后6 h，可见少量微血管段贴壁不牢，100；2.1%明胶涂布的培养皿接种后12 h，可见一些内皮细胞游离长出，100；3.鼠尾胶涂布的培养皿接种后6 h，可见少量微血管段贴壁不牢，100；4.鼠尾胶涂布的培养皿接种后12 h，可见一些内皮细胞游离长出，100；5.纤连蛋白/型胶原涂布的培养皿接种后6 h，可见一些微血管段贴壁并有内皮细胞游离长出，100；6.纤连蛋白/型胶原涂布的培养皿接种后12 h，可见大多数微血管段贴壁及内皮细胞游离长出，100；-16-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 第二节 大鼠脑微血管内皮细胞培养(之二)第二节 大鼠脑微血管内皮细胞培养(之二)zhaoqingshan 1 材料材料 1.1 动物 1.1 动物 雄性 Wistar 大鼠，体重 60g10g。1.2 试剂 1.2 试剂 M199(Hyclone)，DMEM(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，内皮细胞生长因子(ECGF，ROCHE)，肝素钠，青链霉素(HyClone)，明胶(Sigma)，型胶原酶(GIBCO)，胰蛋白酶(Hyclone)，PBS，1%明胶 PBS 溶液。培养液：DMEM，25%胎牛血清，150g/mlECGF，100U/ml 肝素钠，100U/ml 青链霉素；冲洗液：M199，8%新生牛血清，100U/ml 肝素钠，100U/ml 青链霉素。1.3 仪器 1.3 仪器 CO2培养箱，15ml匀浆器；消毒手术器械、75 m及 145 m尼龙滤网。2 方法方法 雄性Wistar大鼠，3.5%水合氯醛腹腔麻醉，断头后浸泡于 75%酒精中 2 分钟，无菌条件下取脑。将鼠脑在PBS中冲洗 2 遍后，在冲洗液中剥离软脑膜及肉眼可见的大血管，去除大脑白质及小脑，收集大脑皮质，充分剪碎。将剪碎的脑组织制成匀浆后过 145 m滤网，取滤液过 75 m滤网，弃滤液，用冲洗液冲洗并收集滤网上的血管段。将血管段置于 2 个离心管内于 1500 rpm离心 8 min后加入 0.1%型胶原酶在 37水浴中消化 15 min，1500 rpm离心 5 min，冲洗液吹打均匀后 1500 rpm离心 5 min，反复 3 次，最后 1 次离心后，弃上清，用培养液重悬沉淀，制成大鼠脑微血管段悬浮液，接种于预先铺好明胶的培养瓶中。在CO2培养箱中孵育 1.5 h后，小心吸弃上清液的一半，培养 3 天后换液。7-8 天细胞长成融合状态，1:2 传代，细胞传代至第 3 代用于实验。3 结果结果 原代培养时，单个大鼠脑微血管内皮细胞(rCMEC)呈多角形或梭形。当细胞生长成片时，单层生长，连接紧密，呈典型的铺路石样。传代细胞，呈短梭形，连接紧密。详见下图。-17-丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养 普通光镜下 rCMEC 图 4 讨论讨论 本方法的原理是，在匀浆前尽可能去除大血管和白质，匀浆后过 145 m 滤网，去除小血管及神经胶质；过 75 m 尼龙滤网，去除神经细胞和血细胞，这样就可获得较纯的微血管段。在胶原酶的作用下，使 rCMEC 与基底膜结合松弛，易于分离。种植后，已与基底膜呈半结合状态的 rCMEC 迅速“爬出”微血管段，逐渐生长成片。但其中尚夹杂有神经细胞、胶质细胞、成纤维细胞及血管平滑肌细胞。由于 EC贴壁快，在 1-3 h 内即开始贴壁，而神经细胞、胶质细胞和血管平滑肌细胞贴壁需要更长时间，所以采取接种后 1.5 h 吸去上 1/2 培养液，去除大部分杂质细胞。在第一次传代时，采取高密度接种，利用 VEC 快速贴壁的特点，有效占据生长空间，从而抑制其它细胞的生长。此外，培养液中给予较高浓度的内皮细胞生长因子(150 g/ml)，促进内皮细胞增殖，高浓度的牛血清(25%)一方面促进 VEC 增殖，另外一方面抑制成纤维细胞生长。因此，经过两次传代后，rCMEC 的纯度基本接近 100%，细胞状态非常稳定，可用于实验。-18-丁香园细胞技术讨论版电子文集 人脐静脉内皮细胞培养 第三节 人脐静脉内皮细胞培养 第三节 人脐静脉内皮细胞培养 zhaoqingshan、好好学习、ygtong、caolutj 1 材料材料 1.1 取材 1.1 取材 新鲜脐带(无菌的广口瓶，内装预冷的 PBS，并加上 200 U/ml 青链霉素)，产后 4 h 内最佳，一定不要超过 24 h，实验前保存在 4冰箱中。1.2 试剂 1.2 试剂 0.1%的I型胶原酶(用培养基配成，如DMEM、M199 均可)；培养液(M199、50 g/ml ECGF、20%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2 mmolL-1谷氨酰胺、100 U/ml肝素钠)，也可以选择其它的生长因子。平衡盐液(生理盐水或者PBS或者D-hanks液)；1%明胶PBS。1.3 器械 1.3 器械 烧杯(脐带数2)、止血钳(脐带数22)、镊子 2 把、手术直剪(脐带数1)、12 号粗针头(去尖，打磨光滑，脐带数1)、玻璃培养皿。2 方法方法 2.1 明胶包被培养瓶过夜，取出明胶，用2