RNA琼脂糖凝胶电泳(2).pdf

RNA 的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤 一、实验目的 掌握植物总 RNA 非变性胶电泳的原理和方法。二、实验原理 RNA 电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用 1.0%-1.4%的凝胶，不同的 RNA 条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA 样品完整性时，配制普通的 1%琼脂糖凝胶即可。三、实验材料、器具及药品 蘑菇的总 RNA 溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE 电泳缓冲液，0.5g/ml 溴化乙锭（EB）10X 载样缓冲液。四、实验步骤（1）用 1TAE 电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加 1TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA 样品 4l 于封口膜上。在实验台上再加入 5l 1TAE 电泳缓冲液及 1l 的 10X 载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至 100V，使 RNA 由负极向正极电泳，约 30min 后将凝胶放入 EB 染液中染色 5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察 RNA 电泳结果。RNA 的变性琼脂糖凝胶检测 试剂：（1）MOPS 缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(Ph7.0)，0.1mol/L NaAc,10mol/L EDTA。（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。（3）甲醛。（4）去离子甲酰胺。v 电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗乙醇干燥3%H2O2 灌满室温放置 10 分钟0.1%DEPC 水冲洗。操作：（1）将制胶用具用 70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。（2）配制琼脂糖凝胶。称取 0.5g 琼脂糖，置干净的 100ml 锥形瓶中，加入 40ml 蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至 60-70，依次向其中加入 9ml 甲醛、5ml 10X MOPS 缓冲液和 0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。（3）样品准备：取 DEPC 处理过的 500ul 小离心管，依次加入如下试剂：10 x MOPS 缓冲液 2ul，甲醛 3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。将离心管置于 60水浴中保 10 分钟，再置冰上 2 分钟。向管中加入 3ul 上样染料，混匀。（4）上样。（5）电泳：电泳槽内加入 1XMOPS 缓冲液，于 7.5V/ml 的电压下电泳。（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。