RIP实验(1).pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 1 RIPRIP 实验实验 1.1.实验原理实验原理 运用针对目标蛋白的抗体把相应的 RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化对结合在复合物上的 RNA 进行分析.解螺旋 http:/ 已知蛋白，找与之相互作用的 lncRNA 3.3.实验实验材料材料 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 PBS(pH=7.4)10多聚体裂解液 5NT-2 buffer NET-2 buffer。甲醛 核重悬 Buffer IP Buffer 蛋白酶 K 消化 Buffer 3.2.3.2.主要仪器主要仪器 离心机 旋转仪 涡旋振荡器 4.4.实验步骤实验步骤 4.1.4.1.裂解裂解液液准备：准备：1)细胞悬液 1000 rpm/min，4 C 离心 5min，弃上清；2)用 1 预冷 PBS 洗 2 遍，弃上清；3)用等体积的 1多聚体裂解液重悬细胞，轻轻吹散，冰浴 5min。4.2.4.2.磁珠与抗体准备：磁珠与抗体准备：1)protein-A/G 包被的磁珠充分重悬，取 75l 至 1.5 ml EP 管中；2)NT-2 buffer 洗涤 2 次；3)用 100 l NT-2 buffer 重悬，加目标抗体 5g，室温混匀 1h；解螺旋 陪伴医生科研成长 http:/ 2 4)5000 g 离心 15 s，加磁座吸附磁珠，弃上清；5)从磁座上取下管子，加 1ml NT-2，吹打混匀，5000 g 离心 15 s，重复 5 次；6)900l NET-2 buffer 重悬磁珠，冰浴备用。4.3.4.3.RIPRIP：1)将存放在-80 C 的细胞裂解液 20000 g，4 C 离心 10 min；2)取 100l 上清至制备好的 900l NET-2 buffer 重悬的磁珠中，进行抗体孵育，每个体系的体积为 1ml；3)取出 10l 的样品作为 Input，-80 C 保存备用；4)垂直混合器 4 C 过夜；5)离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置 1min 后弃上清；6)加 1ml NT-2，强力震荡混匀；7)离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置 1min 后弃上清，重复 5 次；8)沉淀即为 RIP 实验获得的样品，可进一步通过蛋白酶 K 消化后提取 RNA 进行后续分析。解螺旋 http:/ 1 1.Jiang R,Tang J,Chen Y,et al.The long noncoding RNA lnc-EGFR stimulates T-regulatory cells differentiation thus promoting hepatocellular carcinoma immune evasion.Nat Commun 2017;8 8:15129.