紫外吸收差法2.pdf

Y Y S W D B 0 0 9 5 蛋白质含量测定紫外光谱2 8 0 n m 和2 6 0 n m 的吸收差法 YY-SW-DB-0095 蛋白质含量测定紫外光谱2 8 0 n m 和2 6 0 n m 的吸收差法 1.范围 本方法采用紫外吸收法测定蛋白质含量 本方法适用于各类蛋白质适用蛋白质浓度范围为0.1 m g m L-11.0 m g m L-1 2.原理 2.1 蛋白质分子中所含的酪氨酸和色氨酸残基使蛋白质在2 8 O n m 下具有最大吸收值这是因为两种氨基酸残基的苯环中含有共轭双键在一定的浓度范围内蛋白质溶液的2 8 0 n m 光吸收值与其浓度成正比因此可用作定量测定 但不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同所处的微环境也不同因此不同的蛋白质溶液在2 8 0 n m 的光吸收值也不同但区别不十分明显据统计浓度为1 m g m L 的1 8 0 0 种蛋白质溶液在2 8 0 n m 处的光吸收值在0.3 3.0 之间平均为1.2 5 0.5 1 核酸核苷酸碱基等物质在紫外区也有强吸收且这些物质在生物材料中含量丰富常与蛋白质类相互干扰 但二者的紫外吸收特性不一样 核酸类物质在2 6 O n m 的光吸收比2 8 0 n m更强而蛋白质正相反因此可利用2 8 0 n m 和2 6 0 n m 的吸收差来计算蛋白质浓度 紫外吸收法操作简便快捷不消耗样品低浓度的盐类不干扰测定在生化研究中应用广泛尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测但也有相当的物质对紫外法有干扰如核酸等 3.试剂 氯化钠 4.仪器 紫外分光光度计 5.试样制备 5.1 标准蛋白溶液 牛血清白蛋白溶液用9 m g m L-1的N a C l 配制成浓度为1 m g m L-1的溶液 5.2 待测蛋白溶液 蛋白质浓度控制在1.5 m g m L-12.5 m g m L-1范围内 6.操作步骤 6.1 2 8 O n m 和2 6 0 n m 的吸收差法 方法是直接取蛋白质样品选用1 c m 光径的石英比色杯以相应的溶剂作空白对照分别于2 6 O n m 和2 8 0 n m 读光吸收值依据上述经验公式即可求出待测蛋白质样品的浓度 7.结果计算 经验公式是 蛋白质浓度m g m L-11.4 5 A2 8 0一0.7 4 A2 6 0 假设1 m g m L-1蛋白质溶液的A 2 8 0 1.0 8.参考文献 1.李如亮 主编.生物化学实验.武汉武汉大学出版社1 9 9 8.3 7-5 8 2.张龙翔等 主编.生化实验方法和技术.北京:高等教育出版社1 9 9 7.1 3 6-1 4 4 3.李建武等 合编.生物化学实验原理和方法.北京:北京大学出版社1 9 9 4.1 5 0-1 7 4