代谢组学分析疤痕憩室合并宫...患者新鲜胚胎移植的妊娠影响_韩艳.pdf

代谢组学分析疤痕憩室合并宫腔积液 患者新鲜胚胎移植的妊娠影响韩艳，邓星，彭伟，段超群，李清，刘珍（宜春市妇幼保健院生殖科，江西宜春 ）摘要：目的：本文通过在体外受精（）或卵胞浆内单精子显微注射（）新鲜周期移植前，对有剖宫产疤痕憩室（）合并宫腔积液的患者抽取宫腔积液，将抽出的宫腔积液采用代谢组学方法分析代谢差异物，从而探讨宫腔积液对临床妊娠影响的分子机制。方法：将符合入组条件的患者宫腔积液样本根据移植后是否临床妊娠分为两组，临床妊娠组（）和非临床妊娠组（），进行液相色谱串联质谱技术检测，对数据进行统计学和生物信息学分析。结果：两组比较共鉴定出 种代谢产物存在差异，其中临床妊娠组上调表达代谢物 种（，），下调表达代谢物种（，）。对代谢物进行京都基因与基因组百科全书（）富集分析，结果差异代谢物在亚精胺和精胺生物合成、嘌呤代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢通路中富集明显，其中亚精胺和精胺生物合成通路富集最显著，涉及的差异代谢物为鸟氨酸、亚精胺和精胺。结论：剖宫产疤痕憩室新鲜周期移植患者宫腔积液可能存在氨基酸代谢，乙酰辅酶合成等多条生物代谢通路的异常变化。核苷酸、氨基酸等被影响会间接或直接影响到三羧酸循环、糖酵解等代谢过程，这些生物学过程的改变可能影响到胚胎的种植。关键词：疤痕憩室；宫腔积液；液相色谱串联质谱；代谢组学；氨基酸代谢中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：（），（）（），（）（）：，（）（），：，（，），（，）（），：；第 卷第 期 年 月宜春学院学报 ，收稿日期：基金项目：江西省卫生健康委员会科技计划项目（编号：）。作者简介：韩艳（），女，江西宜春人，副主任医师，硕士，研究方向为生殖医学。近年来，剖宫产的比率在不断上升，全球范围内的平均剖宫产率从 年的 增加至 年的 。而我国的剖宫产率处于相对较高水平，多中心研究显示，我国平均剖宫产率为 。随着 年月我国“二孩”政策的全面实施，既往有剖宫产史的妇女需要借助体外受精 卵胞浆内单精子注射（，）技术再次妊娠的比例大大增加。剖宫产疤痕憩室（，）指的是剖宫产术后子宫切口局部愈合不良，可能会形成与宫腔相通的凹陷，形似憩室。有研究指出，应用经阴道超声时，发生率为 ，应用宫腔超声造影时，发生率为 。较多研究报道，可以减少胚胎植入的机会。在临床工作中，很大一部分 患者可合并宫腔积液（，），而针对这部分患者的临床研究较少，一项针对 名 患者的回顾性研究报道，与阴道分娩史的患者相比（），有剖宫产史的患者临床妊娠率较低（），而在剖宫产疤痕憩室合并宫腔积液的患者中显著降低（）。现有的研究均集中于临床研究，但 以及 如何影响妊娠结局的机制尚不明晰。本研究对 合并 患者在移植前进行 抽吸术，将抽吸液体进行了代谢组学分析，基于代谢组学的高分析通量和差异代谢物的筛选功能，比较 合并 患者妊娠组与非妊娠组 中代谢物的相应变化关联，结合相关代谢通路分析探究宫腔积液影响子宫内膜容受性从而影响胚胎种植的相关机理，以期为改善疤痕憩室合并宫腔积液患者的辅助生殖治疗提供新思路。材料与方法 一般资料宫腔积液样本来源于 年月 年月就诊于宜春市妇幼保健院的疤痕憩室合并宫腔积液患者，排除标准为：女方诊断为多囊卵巢综合症、输卵管积水、宫腔粘连的患者。其中妊娠组（）例，非妊娠组（）例。本研究所有患者均知情同意并签署知情同意书，本研究符合 赫尔辛基宣言。宫腔积液样本的获取与保存对剖宫产合并 伴有宫腔积液组的宫腔积液进行抽吸术获取：对移植日超下呈现子宫内膜线分离的 合并宫腔积液患者，进行超引导下宫腔积液抽吸术，经宫颈置入胚胎移植管并连接注射器负压吸尽积液，具体方法为将移植管经过宫颈插入宫腔，至距离宫底约厘米处，注射器负压吸引。轻轻插入导管，避免使子宫颈受到创伤或接触子宫底。将抽吸得到的宫腔积液样本立即保存于 冰箱。色谱质谱条件采用 系统（，）与 质谱仪（，）联用进行代谢组检测。使用 色谱柱（，）进行色谱分离。色谱条件：使 用 色 谱柱（，）进行色谱分离，进样体积为；柱温 。流动相流速为 。流动相 为超纯水且含 甲酸和流动相为含 甲酸的甲醇。流动相洗脱梯度为：初始流动相为 ，保持分钟，分钟时降至 ，分钟降至 ，并保持至 分钟，然后到 分钟升至 。质谱条件：质谱扫描范围为 ，分别在正、负离子模式下采集数据，分辨率 ，数据采集模式为 。使用氮气作为载气，正离子和负离子模式下喷针电压分别为 和 。鞘气流量 ，辅气体积流量 ；辅气温度 。统计学分析对于患者的基线资料数据统计分析应用 进行。计量资料用均数标准差（）表示，组间比较用检验，时差异有统计学意义。将 采集到的原始数据通过 （）软件处理得到离子信息表，包括代谢物离子质量、峰强度、保留时间等。处理后的数据经过 校正，归一化处理后，导入 （，）进行多元分析，首先对所有样本进行主成分分析（），以便了解妊娠组和非妊娠组总体的变化趋势，然后妊娠组和非妊娠组之间进行正交偏最小二乘判别分析（）分析以比较代谢差异，同时利用 次随机置换检验（）来对 模型进行检验。采用多维分析 和非参数假设检验（）相结合的方法，来筛选组件差异代谢物，筛选标准为：值（），两组间变化倍数 或 ；值 ，两组间变化倍数 或 。差异代谢 物 的 鉴 定 通 过 （，：）进行鉴定。鉴定出的代谢物导入到 进行代谢通路和数据分析。结果 患者的一般资料第 期韩艳，邓星，彭伟，等：代谢组学分析疤痕憩室合并宫腔积液 患者新鲜胚胎移植的妊娠影响第 卷共纳入 个周期患者，其中妊娠组（组）例，非妊娠组（组）例。两组患者平均年龄、不孕年限、基础 、基础、基础 等指标均无统计学差异（表）。分别例举两组中各一名患者所移植发育的图像，从受精第 天，复苏为。（图）。表 患者的基础情况项目 组 组值值年龄（岁）不孕年限（年）体质量指数（）基础 （）基础（）基础（）（）窦卵泡计数 （个）移植优胚数（枚）内膜厚度（）图 患者胚胎移植中所移植胚胎图像（倍）主成分分析采用 方法对所有样品数据进行模式识别，结果如图所示，样品聚合良好，表明在本次实验过程中仪器稳定，采集到的数据稳定可靠，数据质量满足进一步分析的要求。图 质量控制样品的 聚类分析结果注：绿色点表示质控样品，蓝色点表示实验样品。单变量分析本研究中采用 和变异倍数分析结合的单变量分析方法对数据所反映的数量变动进行分析。在显著性分析后，分别对 和 作 ，（）转换，最终结果以火山图（图）形式呈现 和 （）两个指标之间的关系。分别以差异倍数 或 ，（图 和图）和 或 ，（图 和图）作为筛选差异代谢物的条件。图 宫腔积液代谢物正、负离子两种模式下的火山图注：图中每个点代表一个代谢物，红色点为显著性差异代谢物，其余点为黑色。第 期 宜春学院学报 第 卷通过单变量分析后，分别从正模式、负模式下确定了不同数量的代谢物，具体数量见表。表 不同筛选条件，正负模式下的代谢物数量代谢物数量正模式负模式 或 ；或 ；或 ；或 ；样本多变量分析 是一种正交偏最小二乘判别分析，区别于主成分分析，可以较大程度的反映不同分组代谢物之间的差异，同时通过计算不同变量投影的重要度（）来衡量不同代谢物表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助代谢物的筛选。通过设置 最终得到 个代谢物（图）。图宫腔积液代谢物正、负两种模式下的 分析结果注：图中每个点代表一个样本，绿色点为非妊娠组，蓝色点为妊娠组。妊娠组与非妊娠组间差异代谢物的分层聚类热图图 差异代谢物分层聚类热图通过，筛选 种代谢物。聚类热图（图）显示，两组中代谢生物标志物之间存在较为明显的聚类结果，在 组中呈现上调变化的“模块”中的代谢物在 组中呈现下调变化，在 组中表现为下降变化的区域在 组中呈现上升变化趋势。疤痕憩室合并宫腔积液患者的宫腔积液差异代谢物中不同聚类结果可能预示着未妊娠患者体内发生了不同的代谢通路变化，基于此后期分别针对差异代谢物进行通路富集分析，揭示相关变化的生物学意义，为临床检测及相关研究提供理论依据。妊娠组与非妊娠组间差异代谢物生物通路富集分析基于 的分析结果，我们进一步对相关代谢物进行生物通路富集分析。通过对不同模式的分析发现，组和 组相比可能会涉及氨基酸代谢，乙酰辅酶合成等多条生物代谢通路的异常变化（图、图）。核苷酸、氨基酸等被影响会间接或直接影响到 循环、糖酵解等代谢过程，从而影响胚胎的种植过程。图 正模式下生物代谢通路富集结果图 负模式下生物代谢通路富集结果 讨论剖宫产子宫疤痕憩室是剖宫产术的远期并发症之一。年，欧洲子宫憩室工作组正式将通过阴道超声评估的剖宫产切口处深度至少为的凹陷定义第 期韩艳，邓星，彭伟，等：代谢组学分析疤痕憩室合并宫腔积液 患者新鲜胚胎移植的妊娠影响第 卷为子宫疤痕憩室。疤痕憩室患者常伴有宫腔积液（）的病理状态，子宫作为胚胎着床发育的场所，对妊娠有极其重要的作用，若宫腔环境异常则会影响胚胎着床。现有研究表明 合并 会影响临床妊娠结局，但具体机制并不明确。近年来，代谢组学在临床领域受到越来越多的关注，一些研究已将特定的代谢模式与子宫内膜异位症、子宫内膜癌、子宫内膜容受性 等联系在一起。代谢物与表型的紧密联系意味着代谢组学可以作为实时评估代谢状态的有力工具。但目前鲜有针对 合并 患者的 代谢组学研究，因此我们研究了这类患者的 代谢组，以便确定妊娠和非妊娠周期中最相关的差异代谢物，从而寻找影响胚胎着床的关键代谢物。本文使用非靶向的 方法对宫腔积液样本进行代谢组学分析，共鉴定到了 个初级代谢物，经多元变量模式识别 和 分析结合富集分析逐步筛选出 种差异表达代谢物（，），其中 种代谢物含量在临床妊娠组（组）升高，包括：谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、肌酸、亚精胺、精胺、柠檬酸、苹果酸、乙酰天冬氨酸等，分属于氨基酸类、有机酸类、胺类及其他类化合物，种代谢物含量降低（色氨酸三甲基内盐，），差 别 具 有 显 著 性 意 义。经 数据库匹配通路数据库进行搜索和代谢通路分析后，这 种差异性代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、三羧酸循环（）、乙醛酸和二羧酸的代谢等。多胺（腐胺，亚精胺和亚精胺）是脂肪族聚阳离子生物小分子，对于哺乳动物胚胎的生长、发育和存活是必不可少的。精氨酸（）是一种胚胎生长和发育的必需氨基酸，是鸟氨酸等重要生物分子的前体。精氨酸（）转化为鸟氨酸，经鸟氨酸脱羧酶（）脱羧后产生腐胺，而腐胺是产生亚精胺和精胺的底物。有研究表明，亚精胺和精胺是妊娠围植入期滋养外胚层细胞增殖、迁移和分化的关键调节分子。本研究结果显示鸟氨酸、亚精胺、精胺在临床妊娠组（组）呈现上调变化，而在未妊娠组（组）呈现下调变化，因此我们推测未妊娠患者精氨酸和脯氨酸代谢、亚精胺和精胺生物合成通路的异常可能影响了胚胎种植。有趣的是，有研究认为腐胺的水平是随着月经周期的 峰同步变化的，而通过饮食补充腐胺可以降低老年小鼠的卵子非整倍体率，腐胺还与胚胎滋养外胚层的发育有关，因此精氨酸代谢通路中的腐胺在辅助生殖中的应用值得我们关注及进一步研究。谷氨酰胺和葡萄糖是胚胎发育过程中的主要能源。这些营养物质可以通过谷氨酰胺果糖磷酸酰胺基转移酶（）介导的 雷帕霉素复合物相关蛋白（，以前称为 ）信号传导途径来增强胚胎滋养层细胞的生长和发育。氨基酸代谢在早期胚胎生长发育中发挥着十分重要的作用，它不仅可以为胚胎的生长发育提供营养物质，维持渗透压，还可以拮抗活性氧和清除胚胎新陈代谢生成的氨。谷氨酰胺通过氨基酸转移酶合成谷氨酸，谷氨酸分解产生 酮戊二酸，酮戊二酸进一步分解反应形成丙酮酸，上述物质在柠檬酸循环（三羧酸循环）的作用下形成三磷酸腺苷，这就是胚胎所需要的能量来源。此外，谷氨酸还可为再次合成嘧啶和嘌呤提供相关碳源和氮源，并以还原剂的角色来保护细胞免受氧化应激。并且在乳酸代谢中，天冬氨酸通过苹果酸穿梭机制为代谢调节发挥重要作用，这都是胚胎生长发育必不可少的代谢途径。两组患者宫腔积液代谢组学分析结果发现，相较于 组，谷氨酸、谷氨酰胺、柠檬酸、苹果酸、乙酰天冬氨酸在 组呈现下调变化，我们推测未妊娠患者的天冬氨酸和谷氨酸代谢、三羧酸循环（）异常