植物组织培养(6)(1).ppt

6 花药和花粉培养（单倍体诱导）,目的,花药和花粉培养的目的是通过使小孢子或花粉粒反复分裂形成胚状体并获得单倍体植物，或者获得芽的形成，然后通过胚胎发生或芽的生长形成单倍体。其染色体组成可以通过秋水仙碱或再生技术获得可繁殖的同型纯合二倍体。,世代交替,6.1 花药和花粉培养概念,花药培养：将花粉发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化为苗的技术。花粉培养：先将花粉从花药中游离出来，再进行离体培养。共同点：利用花粉（小孢子）染色体的单倍性，培育单倍体植株。,6.2 培养方法,花粉发育时期：四分孢子期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）。其中单核期（尤其中、晚期）是大多数植物花粉诱导的最佳时期。,花粉粒发育不同阶段的形态,百合成熟花粉粒,花粉发育时期的检测：压片法：醋酸洋红；碘碘化钾染色外形：,Different flower stages as used in anther culture.Stage 2 is the optimum stage of developmentfor use in tobacco anther culture,6.3 培养过程,6.3.1 花药培养材料预处理：低温、花药离心、低剂量辐射、化学试剂（如乙烯利）等。表面消毒接种培养：两条途径（胚状体；器官分化），影响因素（光照、温度等）。,6.3.2 花粉培养,花粉的分离挤压法：机械损伤、释放抑制物质磁搅拌法漂浮释放法：要预处理,2.培养方法,固体培养液体培养：刚好没底看护培养微室培养：悬滴培养条件培养：培养基中加入花药提取物。,看护培养,将完整花药接种在琼脂培养基上。将一片无菌滤纸放在花药上。将花粉粒接种在滤纸上。看护组织可以相同，也可以不同。,6.4 培养基,基本培养基：MS、H适合双子叶B5适合豆科、十字花科Nitsch适合芸苔属和曼陀罗属N6适合禾本科植物,激素种类和浓度,细胞分裂素生长素,蔗糖和有机添加物,高蔗糖浓度（双子叶3，单子叶6-10）有机添加物：椰乳活性炭,Anther and haploidplantlets on a solid medium containing activated charcoal,Anther and haploid plantlets on a liquid medium containing activated charcoal,Anther and haploid plantlets on a double layer medium.The solid lower part contains charcoal while the upper liquid layer contains the growth regulators,6.5 单倍体植株的鉴定,花粉植株的倍性：不同倍性来源：核内有丝分裂、畸变核融合；花药壁污染,形态学鉴定：形态特征、结实性、花粉粒大小和着色、气孔大小和数目等；细胞学鉴定分子标记鉴定,6.6 单倍体植株的染色体加倍,自然加倍：核有丝分裂和核融合人工加倍：秋水仙素愈伤组织再生：组织创伤法,6.7 花粉花药培养的优点,缩短育种年限。提高选择效率：有利于隐性基因性状的选择。获得单性别特殊材料：如超雄株。作为遗传研究材料。我国成就：禾本科经济作物。,6.8 花粉花药培养的缺点,诱导频率低：有的只有百分之几、千分之几甚至更低；体细胞干扰问题；倍性变异问题；白化苗问题。,烟草花药雄核发育过程,7天,Anther after culture initiation.Anther wall has burst open andglobular embryos and developingmicrospores are visible,7天,Microscopic cross section of an anther 7 days after culture initiation.Anther wall has burst open and globular embryos and developing microspores are visible.The original exine from the developing microspores/pollen grains are stained red.,14天,Globular embryos are visible14 days after initiation,14天,Microscopic cross section ofan anther 14 days after cultureinitiation.Globular embryosare visible 14 days after initiation,21天,Advanced heart shaped(cylindrical)and torpedo stageembryos are visible in the anther,21天,Microscopic cross section.Advanced heart shaped(cylindrical)and torpedo stageembryos are visible.Vasculartissue is visible in some of the embryos,之后,Tobacco anther with rooted haploid plantlets,Tobacco anther with developing haploid plantlet,arising from the microspore,复习思考题,什么是花药培养和花粉培养？有何用途？花药和花粉培养的最佳取材时期是什么时候？花粉培养有哪些培养方法？怎么进行花粉分离？,7 组培与育种,单倍体育种突变育种培育远源杂种基因工程育种,突变育种,根据突变原因可分为诱变和无性系变异。根据突变的主体可分为外植体突变和接种体突变（愈伤组织突变、悬浮细胞突变和不定芽突变等）,愈伤组织、悬浮培养细胞易变异、细胞数量大，有利于突变体筛选。多用于抗性筛选（给予胁迫条件，进行定向筛选）。已选出一些抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产。,诱变（芽诱变、愈伤组织诱变）,目的：通过化学或射线处理获得变异。物理突变剂：X-射线，伽马射线，紫外线等化学突变剂：EMS（甲基磺酸乙酯）、叠氮钠等,control chamber,generation of gamma radiation,irradiation of plant material,多用于筛选杂色植物。,香蕉杜鹃花玫瑰,Banana meristem pieces,are irradiated in a gamma cell.,and subcultured in vitro.,Regenerated plants,.are transplanted in the field,where a further selection takes place.,Finally a new Cavendishbanana mutant was introduced,Screening thousands of irradiated shoots.,to obtain a few mutants,A rose culture is initated in vitro,Shoot tips are irradiated,and multiplied for 5 subcultures,Chlorophyll deficient mutant of rose obtained after gammairradiation,original cultivar,red mutant,white mutant,嵌合体和杂色植物,嵌合体植物是指顶端层一到两层细胞遗传上有差异的植物。,Draceana,顶端分生组织,高等植物芽顶点（分生组织）是多细胞和多层的。大多数双子叶植物：3层 2个被囊层（L1和L2）1个基层（L3）单子叶植物：23层通常，有序的细胞分裂面防止了各层之间的混淆。,multilayered apex,顶端分生组织的每一层将形成植物的某一特定组织。L1：叶表皮、茎表皮（包括刺）和花表皮L2：栅栏组织、叶缘、配子、花瓣、茎L3：海绵组织、叶脉、根和茎的中间部分,类型,扇形嵌合体：遗传上不同的细胞嵌入顶点的所有层次。边缘嵌合体：一到两层顶点细胞的一部分有遗传差异。外周嵌合体：一到两层顶点细胞整层有遗传差异。,核或叶绿体突变,顶点细胞遗传组成上的任何改变都可能引起嵌合体,色素突变,叶绿体突变,遗传单元的换位,在特殊的种或特殊的遗传背景下，一系列遗传单元偶尔可能从染色体某一位置转换到另一位置，或引起染色体断裂，结果产生遗传镶嵌。当插入影响到色素基因，就出现斑点。这一现象在玉米、矮牵牛和番薯属植物均有描述。,Jumping genes in Petunia,嫁接,自发的嵌合体嫁接：1674年：奇异的桔子 佛罗伦萨一个园丁把酸橙的一个幼芽嫁接到香橼苗的茎干上。芽没有被接受，而在茎干上的愈伤组织中却形成了另一个芽。在同一植株上，有叶子，有花，也有果实，可以与香橼区别开，也有两者混合的果实或有各种不同的变化。,香橼,酸橙,1825年：+Laburnocytisius adamii亚当是巴黎附近Vitry的一名园艺工人，他把金雀花树皮上的盾插入到普通的金莲花茎干中。芽休眠了一年后萌发出大量的新芽，其中一个长得比其他更直更有力，叶子比一般的金雀花大。这个称为+Laburnocytisius adamii的品种在欧洲广泛传播。这种树性状不稳定，容易回复到双亲种的花和叶的性状。,金莲花 金雀花,离体合成嵌合体,愈伤组织混合 不同基因型的细胞集合成的愈伤组织上可以长出嵌合的芽。这样的愈伤组织可以通过突变或将两种（或更多）遗传上有差异的植物愈伤组织混合来获得。芽的诱导必须是多细胞起源的。,离体嫁接 活体和离体一样，从主根或幼芽来的细胞在嫁接部位可帮助形成新芽。当结合部位或鞍部痊愈时，除了很薄的一层组织，幼芽其他部位都去掉。所有不是从嫁接部位生成的芽也都去掉。,半受精,半受精是由反常受精引起的，雄性核子穿透卵细胞但并不与卵细胞融合。雌性和雄性核子分离，结果形成杂合胚，具有母性或父性单倍体组织特性。,嵌合体的离体培养,繁殖 利用茎尖或腋芽来繁殖嵌合体。不要用不定芽或体胚，因为大多数情况下，它们起源于L1、L2或L3其中一层。,Draceana chimera multiplied by axillary shoot,嵌合体分离,嵌合体可以通过诱导不定芽或体胚来分解，因为它们大都起源于一层细胞。,This azalea chimera couldbe decomposed in a carmineand a white cultivar,in vitro adventitious shootson a rose leaf,adventitious shoot formation on rhododendron leaves,杂色植物,定义 杂色器官上不同颜色的不连续斑点。类型 细胞系杂色 从一个突变细胞增殖而来的一群单色的细胞。如果这是一个芽顶点的细胞，杂色植物就是嵌合体（不是通过有性遗传获得的）。非细胞系杂色 所有的细胞基因型相同，但色素基因表达不同（有性遗传）。,Coleus blumei,不是所有的嵌合体都是杂色的不是所有的杂色都是嵌合体,例子,植物中，杂色最常见于叶片或花瓣出现不同的颜色,斑纹 大斑点 条纹 边缘,以上展示的玫瑰和也门铁是嵌合体，玫红点嫣红蔓和花叶万年青则不是。,起源,杂色原因,复习思考题,什么是植物快繁？有何特点？植物快繁的器官形成方式有哪些？各有什么特点？简述植物快繁的程序。什么是嵌合体？如何离体合成、培养或分离嵌合体？嵌合体和杂色植物是同一概念吗？,8 植物离体繁殖,植物快繁是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的技术。也叫植物离体繁殖或微繁。,植物快繁的特点,繁殖效率高。周年繁殖，生长速度快。培养条件可控性强。占用空间小。30m2 可培育数十万株苗木。管理方便，利于自动化控制。便于种质保存和交换。,8.1 植物快繁的器官形成方式,短枝发生型丛生芽发生型不定芽发生型胚状体发生型原球茎发生型,短枝发生型,概念：带叶茎段形成完整植株，再剪成带叶茎段继代成苗。特点：一次成苗，性状稳定，过程简单，成活率高。花卉和葡萄的试管苗生产常用此法。,丛生芽发生型,概念：顶芽或腋芽不断发生腋芽而呈丛生芽，再将单芽诱导生根成苗。特点：性状稳定，增殖率高。大多数植物快繁的主要方式。,axillary branching ina chimeral Dracaena,腋芽,不定芽发生型,概念：外植体脱分化形成愈伤组织，再分化产生不定芽，或不经愈伤组织直接形成不定芽，再将芽诱导生根成苗。特点：增殖率高于丛生芽发生型，但较易变异，并会导致嵌合性状发生分离。许多植物快繁的主要方式。,adventitious bud developmentin a chimeral Dracaena不定芽,胚状体发生型,概念：外植体经愈伤组织发育成胚状体或直接发育成胚状体，直接成苗。特点：增殖率最高，但胚状体发生和发育较复杂。目前此法应用尚不广泛。,原球茎发生型,概念：茎尖或腋芽培养产生原球茎，增殖形成原球茎丛，再切割增殖或培养成完整植株。是兰花唯一有效的大规模无性繁殖方法，促使了兰花工业的形成。,1960年，Morel利用兰花茎尖培养，实现了脱毒和快速繁殖的两个目的。这一技术导致欧洲、美洲和东南亚许多国家“兰花工业”的兴起。,大花蕙兰原球茎,兰花原球茎切块再生形成茎的过程,石斛原球茎 石斛组培苗,石斛原球茎,8.2 植物快繁的程序,阶段：无菌培养的建立；阶段：繁殖体的增殖；阶段：芽苗的生根；阶段：小植株的移栽驯化。,8.2.1 阶段：无菌培养的建立,母株和外植体的选取无菌培养物的获得外植体的启动生长,母株和外植体的选取,母株标准：性状稳定、生长健壮、无病虫害。外植体：木本、较大草本：带芽茎段、顶芽、腋芽等。易繁殖、矮小或具短茎的草本：叶片、叶柄、花茎、花瓣等。,mother plants,drip-irrigated滴灌母株,young shoots are cut off剪下幼嫩枝条,当植株的其他部位难以消毒时，可以选用种子，消毒后的种子在无菌条件下播种到含有水琼脂培养基上或1/10 MS培养基上使其发芽。将经消毒的幼苗切成小片，作为外植体。,无菌培养物的获得,灭菌接种检测充分的灭菌和“不受污染”的高存活率之间的折中。,leaves are discarded,petioles remain on the shoot去叶，保留叶柄,rinse with 80%ethanol,sterilize in 10%commercial bleach(NaOCl)for 15 minutes,rinse 3x with sterile water,cut off basal end and top,cut nodes,each node contains an axillary meristem,bring the node in a test tube,ready,外植体的启动生长,腋芽生长伤口处产生不定芽产生愈伤组织,阶段一般需要46周；有些木本植物需要1年。,8.2.2 阶段：繁殖体的增殖,培养材料的增殖：48周/代。增殖培养基：细胞分裂素和矿质元素浓度高于阶段。增值体的大小和切割方法：1个茎节。,8.2.3 阶段：芽苗的生根,离体生根：培养基的无机盐浓度是阶段的1/2或1/4，减少或除去细胞分裂素，增加生长素。活体生根：芽苗先在生长素溶液中快速浸蘸，再温室培养基质中高湿度培养。阶段一般转接一次就可完成，24周。,8.2.4 阶段：小植株的移栽驯化,移栽前应进行高光强炼苗，使植株生长粗壮，并打开瓶口，降低湿度。移栽：洗去培养基，栽入人工培养基质（如蛭石、珍珠岩、粗沙、泥炭等按比例混合，保湿透气），几天后可形成新的功能根系。驯化管理：覆膜、喷雾，逐渐降低湿度、提高光强，防止菌类滋生。,