Chapter 10 复制.ppt

基因信息的传递,第 十 章 DNA 的生物合成,第一节 DNA的生物合成（复制）第二节 DNA损伤与修复,内容提要：,基 因(gene)：为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。基 因 组（genome)：某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。,转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,*中心法则(the central dogma),转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis(Replication),第 一 节,DNA的生物合成复制(replication)：以亲代DNA为模板，按照碱基互补配对规律合成子代DNA的过程。,复制,逆转录,一、半保留复制,DNA生物合成时，亲代DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的新链。在子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代，另一条是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,（一）半保留复制的概念,全保留式 半保留式 混合式,DNA复制的三种可能方式,（二）DNA半保留复制的实验依据,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,（三）半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、复制的方向双向复制,复制原点（origins of replication）：又叫复制的起始点，是指DNA复制开始的特定的位点。这个区域通常由富含A/T碱基对的特殊碱基序列组成，能结合各种蛋白，有助于解开螺旋，启动复制。,复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉(replication fork)。,原核生物：基因组是环状DNA 只有一个复制起始点 复制时，DNA从复制原点向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，两个叉均参与DNA的复制，并以几乎相等的速率移动，称为双向复制（bidirectional replication）。,在原核生物双向复制中，DNA被描述为眼睛状，称为复制。,真核生物：染色体DNA有多个复制起始点。两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉,前导链(leading strand),后随链(lagging strand),复制的半不连续性,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为前导链或领头链(leading strand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链或随从链(lagging strand)。前导链连续复制而后随链不连续复制，就是复制的半不连续性。,冈崎片段：1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。冈崎片段再由DNA连接酶连成一条完整的新链。原核生物:1000-2000个核苷酸 真核生物:100-200个核苷酸,前导链(leading strand),后随链(lagging strand),冈崎片段,半不连续复制,半不连续复制动画,DNA复制的化学反应The chemistry reaction of DNA Replication,三、,（一）DNA复制的体系 底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合酶:依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)模板:解开成单链的DNA母链 引物:提供3-OH末端的一段RNA 其他酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶,（二）复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,聚合反应的特点,DNA新链生成需要以单链DNA为模板需要RNA引物提供3-OH，以dNTP为原料新链的延长只可沿53方向进行,聚合反应机理,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除引物和突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,四、参与复制的主要酶类,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：1.53的聚合活性 2.核酸外切酶活性,（一）DNA聚合酶,1959 年获诺贝尔生理学或医学奖,奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg,1.原核生物的DNA聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol,（1）DNA-pol,多功能酶：5聚合酶活性，对复制和修复中出现的空隙进行填补；5外切酶活性，对复制中的错误进行校对，保证复制准确性；5外切酶活性，去除RNA引物和突变碱基。,DNA聚合酶I的5外切酶活性：识别切除生长链3端的错配核苷酸，每次切除1个核苷酸，该活性对双链DNA不起作用；正常聚合条件下，活性很低，一旦出现碱基错配，DNA聚合酶I的聚合活性被抑制，聚合反应停止，5外切酶活性切除错配核苷酸，再继续聚合；有效的保证DNA复制的高度忠实性。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,605个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol 928 Aa,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,（2）DNA聚合酶II(DNA-pol II)具有5聚合酶活性和5外切酶活性，没有5外切酶活性。只是在无pol及pol的情况下暂时起作用。对模板的特异性不高,参与DNA损伤 的应急状态修复。,（3）DNA聚合酶III(DNA-pol III)是复制延长中真正起催化作用的酶。由10种亚基组成不对称的聚合体。，/ksi/，/it/亚基组成核心酶，亚基具有53的聚合活性，亚基具有35外切酶活性和碱基选择功能，亚基可能起组装作用。,亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。其余亚基统称为-复合物,促进全酶的组装及增强核心酶活性。,DNA-pol,53聚合活性,35外切,DNA夹子,-复合物,大肠杆菌每个细胞中只有1020个DNA pol-III酶分子，但催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶I和II的15倍和30倍，可达150个核苷酸/秒。并且它可连续催化多达5000个核苷酸的加入，因此是真正意义上的DNA复制酶。,E.Coli中的DNA聚合酶,2.真核生物的DNA聚合酶,起始引发，催化后随链的不连续合成。,复制的主要酶，参与前导链的合成。,参与DNA的修复。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),10,8,局部解链后,拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，DNA拓扑异构酶催化DNA链的瞬时断裂和闭合释放长螺旋产生的扭转张力，使复制顺利进行。,拓扑异构酶作用特点兼有内切酶活性和连接酶活性克服解链过程中的打结、缠绕现象,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）,作用机制,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用,（三）解螺旋酶(helicase)位于复制叉前，利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链，便于DNA pol III和引物酶作用。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,（四）引物酶(primase),依赖DNA的RNA聚合酶。可以催化游离NTP聚合形成小段RNA。催化RNA引物的生成，对于DNA合成是必需的。在大肠杆菌，是dna G基因的表达产物。,引物（primer）：是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，引物的3-OH，必须是游离的。,（五）DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP（NAD+）,AMP,5,3,5,3,在复制中起接合双链中单链缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的功能,（六）单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。,解旋解链酶类的作用,